שיעור 2 מסקרנות לשאלת מחקר

חלק 1 - כיצד נוצרת שאלת מחקר?

שאלת המחקר היא נקודת המוצא של העבודה המדעית. עוד לפני שמתכננים ניסויים, בוחרים שיטות או אוספים נתונים, צריך להחליט איזה פער בידע מבקשים לסגור ומדוע דווקא השאלה הזאת חשובה. נושא רחב שמעניין את החוקר יכול להוליד שאלות רבות, אך לא כולן יהיו מתאימות למחקר: חלקן כלליות מדי, אחרות מניחות מראש דבר שעדיין לא הוכח, וחלקן אינן מובילות לבדיקה שתוכל לקדם את ההבנה הקיימת.

נקודת המבט של החוקר

משל העיוורים והפיל ממחיש את האופן שבו חוקרים מתחומים שונים ניגשים לאותה תופעה. כל אדם נוגע בחלק אחר של הפיל ומתאר אותו בהתאם לחלק שהוא מסוגל לחוש. באופן דומה, חקר הסרטן יכול להתמקד במוטציות גנטיות, במטבוליזם של תאים סרטניים, באינטראקציה עם מערכת החיסון, בהזדקנות או בתהליכים אבולוציוניים. אף אחת מנקודות המבט האלה אינה מציגה לבדה את כל התמונה.

הגישה המחקרית המוצגת בשיעור מתמקדת ב־Genome instability (אי־יציבות גנומית): כיצד נוצרים נזקים ב־DNA, ובמיוחד שברים דו־גדיליים (Double-Strand Breaks, DSBs), וכיצד הם עשויים להוביל לשינויים כרומוזומליים בעלי פוטנציאל סרטני. שברים ב־DNA עלולים להוביל לטרנסלוקציות היוצרות Fusion oncogenes, למשל BCR-ABL או MLL1-AF4, או לפגיעה בגנים המדכאים התפתחות סרטן (Tumor suppressor genes), כגון p53 ו־PTEN.

נקודת המבט קובעת אילו שאלות המחקר החוקר מסוגל לזהות ולבדוק, אך אינה מחייבת אותו לחקור רק נושאים המזוהים ישירות עם תחום התמחותו. גם מחקר על חיידק או על תרופה יכול להתמקד באופן שבו הם משפיעים על יציבות הגנום.

פער הידע והשאלה כגשר

שאלה מחקרית טובה מחברת בין הידע הקיים (Existing knowledge) לבין הבנה חדשה (New understanding). היא משמשת מעין גשר מעל פער בידע: צריך לדעת מה כבר ידוע, מה עדיין חסר, ומה ניתן לבחון כדי להתקדם מהמצב הקיים להבנה חדשה.

השאלה אינה חייבת לפתור בבת אחת את כל הבעיה. עם זאת, היא צריכה להתמקד בפער משמעותי וליצור מסלול שאפשר להתקדם בו. כאשר השאלה רחבה מאוד, אפשר לפרק אותה לשאלות קטנות יותר. לעומת זאת, שאלה צרה מדי עלולה לספק נתון מעניין בלי לענות על הבעיה המחקרית המרכזית.

שני מקרי המחקר הבאים מציגים שתי דרכים שונות לפיתוח שאלות: שאלה רחבה שמתפרקת בהדרגה לשאלות ממוקדות, לעומת שאלה ממוקדת שממצאי המחקר מצמיחים ממנה שאלות נוספות.

חלק 2 - מקרה מחקר ראשון: Helicobacter pylori וסרטן קיבה

רקע: מה ידוע על החיידק?

Helicobacter pylori הוא חיידק נפוץ המתיישב ברירית הקיבה. על פי הנתונים שהוצגו, כ־50% מאוכלוסיית העולם נושאים את החיידק, עם הבדלים גאוגרפיים משמעותיים: עד כ־80% בחלק ממדינות המזרח, כ־30% במדינות מערביות וכ־50% בישראל. ההדבקה הראשונית מתרחשת לעיתים קרובות בילדות, בעוד שסרטן הקיבה מופיע בדרך כלל עשרות שנים לאחר מכן.

מרבית הנשאים אינם מפתחים תסמינים. ההדבקה יכולה לגרום ל־Gastritis, וכ־10% מהנדבקים יפתחו כיב פפטי. לפי הנתונים שהוצגו בשיעור, כ־1% מהנדבקים יפתחו סרטן קיבה. מבדילים בין שני סוגים היסטולוגיים עיקריים של סרטן קיבה, Intestinal ו־Diffuse; המחקר בשיעור מתמקד בעיקר בסוג ה־Intestinal, שלו קשר מבוסס להדבקה בחיידק.

לסרטן קיבה כמה גורמי סיכון, ובהם תזונה עתירת מלח, עישון וגורמים גנטיים. H. pylori הוצג כגורם סיכון מרכזי, הקשור לעלייה של בערך פי ארבעה בסיכון לסרטן קיבה, אף שהסיכון מושפע גם מגורמים נוספים.

מה כבר ידוע על התפתחות הסרטן?

המודל Correa’s cascade מתאר התקדמות אפשרית של תהליך ממושך ברירית הקיבה:

דלקת כרונית (Chronic inflammation) → אטרופיה (Atrophy) → מטפלזיה (Metaplasia) → סרטן.

החיידק מסוגל לעורר דלקת כרונית, המעודדת תהליכים הקשורים להישרדות ולפרוליפרציה של תאים. בנוסף, הוצגו תהליכים נוספים התלויים בגורמי החיידק, ובהם CagA, היכולים להשפיע על מסלולי איתות ועל התנהגות התאים. לכן אפשר להסביר חלק מהקשר בין החיידק לסרטן באמצעות הדלקת והשינויים התאיים שהוא מעורר.

אולם ההסבר הזה אינו סוגר את כל פער הידע: גם לאחר סילוק החיידק, תהליך סרטני שכבר החל עשוי להימשך. הכחדת H. pylori מפחיתה את הסיכון להתפתחות סרטן, אך אינה מבטלת אותו לחלוטין, וסרטן קיבה שהתפתח אינו נרפא מעצם מתן אנטיביוטיקה נגד החיידק.

הפער: Hit-and-Run carcinogenesis

התופעה מכונה Hit-and-Run carcinogenesis: גורם מסרטן יכול להתחיל תהליך, להשאיר אחריו שינוי מתמשך בתאים, ולא להיות דרוש עוד להמשך התהליך. מכאן עולה השאלה מהי אותה חתימה (Persistent signature) שהחיידק מותיר אחריו.

מנקודת המבט של אי־יציבות גנומית, עולה האפשרות שהחיידק גורם לנזקי DNA, שחלקם מובילים לשינויים כרומוזומליים הממשיכים להתקיים גם כשהחיידק כבר אינו נמצא. זוהי אפשרות שיש לבדוק, ולא מסקנה שמותר להניח כנכונה בתחילת המחקר.

ניסוח שאלת המחקר

אפשר לנסח כמה שאלות שונות על אותה תופעה, אבל לכל אחת מהן מגבלה אחרת:

השאלה האחרונה מאפשרת להתחיל בחקירה מבלי לדלג על שלבים. מתוך השאלה המרכזית נגזרות שאלות עוקבות: האם החיידק גורם לשברים ב־DNA? היכן בגנום השברים מתרחשים? כיצד הם נוצרים? והאם הם קשורים לשינויים כרומוזומליים שמופיעים בסרטן קיבה?

שאלה ראשונה: האם החיידק גורם לנזקי DNA?

כדי לבחון את השאלה נמדדו סמנים לנזקי DNA בתאים שנחשפו ל־H. pylori, לעומת תאים שלא נחשפו לחיידק. אחד המדדים שנבדקו היה γH2AX, סמן הקשור לתגובה התאית לשברים ב־DNA; נעשה שימוש גם בשיטות נוספות להערכת נזקי DNA.

בתאים שנחשפו לחיידק נמצא אות גבוה יותר של γH2AX בהשוואה לתאים שלא נחשפו. מכאן התקבלה עדות לכך שהדבקה ב־H. pylori אכן גורמת לנזקי DNA. בכך נפתחה הדרך לשאלה הבאה: לא רק האם קיימים שברים, אלא היכן הם נוצרים.

שאלה שנייה: היכן מתרחשים השברים בגנום?

למיפוי השברים נעשה שימוש ב־END-seq, שיטה למיפוי שברים דו־גדיליים לאורך הגנום. כך אפשר להשוות בין תאים שנחשפו לחיידק לתאי ביקורת ולזהות אזורים שבהם האות המצביע על שברים מופיע בתדירות גבוהה יותר.

נמצאו אלפי אתרי שבר חוזרים, והם לא היו מפוזרים בגנום באקראי. השברים הופיעו במיוחד באזורים של כרומטין פעיל, באזורים עשירים בגנים ובסוגים מסוימים של רצפים גנומיים. זוהו שתי קבוצות בולטות: Repetitive DNA elements ואזורים של גנים העשירים ב־R-loops.

למיקום השבר יש משמעות כפולה. ראשית, הוא עשוי ללמד כיצד השבר נוצר, מפני שאזורים שונים פגיעים למנגנונים שונים. שנית, אפשר להשוות בין אתרי השברים לבין אזורים שבהם נמצאו שינויים כרומוזומליים בסרטן. לכן המיפוי אינו רק תיאור גאוגרפי של הגנום: הוא יוצר בסיס להיפותזות חדשות.

שאלה שלישית: כיצד נוצרים השברים?

שתי קבוצות האזורים שנמצאו במיפוי רגישות ל־Replication stress, כלומר למצבים שבהם למזלג השכפול קשה להתקדם. אזורים חוזרניים ו־R-loops עלולים להקשות על התקדמות השכפול, ובתנאים של סטרס שכפולי להפוך לאזורים שבהם נוצרים שברים.

מכאן עלתה אפשרות מנגנונית: הדבקה בחיידק גורמת לירידה במאגר ה־dNTPs, אבני הבניין הדרושות לשכפול DNA. המחסור עלול להאט או לעצור את מזלג השכפול, ובאתרים פגיעים להוביל לנזקי DNA.

במחקר נמצא כי בעקבות החשיפה לחיידק רמות ה־dNTPs בתאים יורדות. כאשר הוסיפו לתאים dNTPs מבחוץ, נצפתה ירידה בנזקי ה־DNA ובאות γH2AX. ההתערבות הזאת חשובה במיוחד: לא רק שנמצא קשר בין החשיפה לחיידק לבין המחסור ב־dNTPs, אלא שהשלמת המחסור הפחיתה את הנזק. לכן הממצאים תומכים בכך שלמחסור ב־dNTPs יש תפקיד מרכזי ב־Genotoxicity של החיידק.

גם כאשר נמצא מנגנון אפשרי, המחקר לא מסתיים. עולות שאלות נוספות, למשל כיצד החיידק גורם לירידה ברמות ה־dNTPs ואילו גורמים בחיידק אחראים לכך. אפשר לבחון שאלות אלה בהמשך באמצעות זני חיידקים שונים ומניפולציות גנטיות. אלה כבר שאלות שנולדו מתוצאות המחקר, ולא בהכרח נשאלו בתחילתו.

שאלה רביעית: האם אתרי השברים קשורים לסרטן קיבה?

כדי להתקרב לשאלת המחקר המרכזית נבדק הקשר בין אתרי השברים שנוצרו בחשיפה ל־H. pylori לבין Breakpoint regions של שינויים כרומוזומליים שנמצאו בגידולים. נמצאה העשרה של אתרי שברים באזורים המתאימים למחיקות כרומוזומליות בסרטן קיבה מסוג Intestinal, ולא אותה התאמה בכמה קבוצות השוואה של סוגי סרטן אחרים שנבדקו.

הממצא מחזק את הרלוונטיות האפשרית של שברי ה־DNA לתהליך הסרטני, אך אינו מוכיח בפני עצמו שהשברים הללו הם שגרמו לסרטן. כדי להמשיך לבחון את הקשר, נעשה שימוש במודלים שבהם תאים נחשפים לחיידק לאורך זמן, ולאחר מכן נבדקים גם אחרי שהחיידק סולק. בין היתר נבחנים שינויים גנטיים ושינויים בביטוי גנים, לרבות באמצעות Whole-genome sequencing. מטרת המחקר המתמשך היא לברר אילו שינויים נותרים בתאים לאחר החשיפה והאם הם יכולים להסביר השפעה מתמשכת.

המהלך המחקרי: השאלה הרחבה על ההשפעה הסרטנית המתמשכת פורקה לשאלות שאפשר לבדוק בהדרגה. כל תשובה סיפקה ראיות לשלב הבא, ובמקביל הולידה שאלות חדשות שלא ניתן היה לנסח באותה רמת דיוק לפני קבלת התוצאות.

חלק 3 - מקרה מחקר שני: Etoposide ולוקמיה שניונית

הרקע הביולוגי: Topoisomerases ושברים ב־DNA

Topoisomerases הם אנזימים שמשנים את המבנה הטופולוגי של ה־DNA ומאפשרים להתמודד עם המתח שנוצר כאשר ה־DNA מסתבך או עובר סופר־סלילה (Supercoiling). שני הסוגים העיקריים שהוצגו הם TOP1, הפועל באמצעות שבר חד־גדילי (SSB), ו־TOP2, הפועל באמצעות שבר דו־גדילי (DSB).

TOP2 יוצר באופן מבוקר שבר דו־גדילי זמני ונשאר קשור ל־DNA בקומפלקס הנקרא TOP2 cleavage complex (TOP2cc). לאחר שינוי המבנה הטופולוגי של ה־DNA, האנזים מחבר מחדש את הגדילים בתהליך של Ligation. במצב התקין השבר זמני, ולכן אין צורך במנגנוני תיקון DNA רגילים כדי להשלים את הפעולה.

לעיתים החיבור מחדש נכשל. במצב כזה ניתן להסיר את החלבון הקשור ל־DNA ולאפשר למנגנוני התיקון לטפל בשבר שנותר. המנגנון הזה חשוב להבנת פעולתה של התרופה Etoposide (ETO).

כיצד Etoposide פועל, ומדוע הוא עלול לגרום לסרטן?

Etoposide היא תרופה כימותרפית המשתייכת ל־Topoisomerase poisons. היא אינה מסתפקת במניעת פעילות האנזים מראש, אלא מייצבת את TOP2cc ומפריעה לחיבור מחדש של גדילי ה־DNA. כך שברים שאמורים להיות זמניים עלולים להישאר כשברים דו־גדיליים.

כאשר נוצרים נזקי DNA רבים, התא עשוי לעבור Apoptosis, וזהו חלק מהאפקט הרצוי בטיפול נגד תאים סרטניים. אולם כאשר שברים אינם מתוקנים באופן תקין, הם עלולים להוביל גם לטרנסלוקציות כרומוזומליות. כך נוצרת התוצאה הפרדוקסלית: תרופה שמטרתה לטפל בסרטן עלולה במיעוט מהמטופלים להיות קשורה להתפתחות סרטן שניוני.

הדוגמה שהוצגה היא Therapy-related Acute Myeloid Leukemia (t-AML), שעל פי הנתונים בשיעור יכולה להופיע אצל כ־3% מהמטופלים בהקשר שהוצג, לעיתים כעבור 3–5 שנים מהטיפול. הנתונים הללו שימשו בהרצאה כרקע לשאלת המחקר המנגנונית, ולא כבסיס להערכת סיכון פרטנית לכל טיפול ב־Etoposide.

התצפית המעוררת שאלה: MLL1 ו־Breakpoint Cluster Region

בכ־30% מהמקרים הרלוונטיים של t-AML שתוארו בהרצאה, נמצאו טרנסלוקציות המערבות את הגן MLL1 (KMT2A). הגן קשור לרגולציה של ביטוי גנים, והטרנסלוקציות שלו עשויות ליצור תוצרי איחוי המשפיעים על התנהגות התאים. מעבר לחזרתיות ברמת הגן, השינויים מתרכזים באזור מסוים בתוכו, המכונה Breakpoint Cluster Region (BCR). אין הכוונה כאן לרצפטור BCR, אלא לאזור גנומי שבו מרוכזים Breakpoints.

החזרתיות מעוררת שאלה: מדוע אותן טרנסלוקציות חוזרות שוב ושוב, ולעיתים באותם אזורים? הוצגו שני הסברים אפשריים שאינם בהכרח סותרים זה את זה:

1. Selection: טרנסלוקציות רבות יכולות להתרחש, אך תאים הנושאים שינוי המקנה יתרון סרטני שורדים ומתרבים; לכן דווקא השינויים האלה יופיעו בתדירות גבוהה בגידולים.
2. Preferential breakage: יש אזורים בגנום שבהם שברים נוצרים בתדירות גבוהה יותר מלכתחילה, בשל רגישות מקומית לפעילות של התרופה או האנזים.

כדי להבחין בין ההסברים לא מספיק לבדוק גידולים שכבר התפתחו. צריך לבדוק היכן נוצרים השברים בעקבות הטיפול, לפני שמתבצע תהליך ארוך של סלקציה בין תאים.

שאלת המחקר הממוקדת

האם Etoposide גורם באופן מועדף לשברי DNA באזורים של Breakpoints הקשורים ללוקמיה?

בניגוד לשאלת המחקר הרחבה במקרה של H. pylori, כאן כבר היה ידע מוקדם על פעולת TOP2, על השפעת התרופה ועל הטרנסלוקציות המוכרות בלוקמיה. לכן היה אפשר להתחיל בשאלה ממוקדת מאוד ובניסוי שמכוון ישירות אליה.

באמצעות END-seq מופו שברי DNA לאחר טיפול ב־Etoposide. במקביל נעשה שימוש ב־ChIP-seq למיפוי האזורים שבהם נמצא TOP2. התגלו אלפי שברים בעקבות הטיפול, עם חפיפה בולטת לאתרי TOP2, וכן שברים באזורים של Breakpoint Cluster Regions בגנים המעורבים בטרנסלוקציות, ובהם MLL1 ושותפיו.

הממצא תומך בכך שלפחות חלק מהחזרתיות בטרנסלוקציות יכול לנבוע מ־רגישות מוגברת של אזורים מסוימים ליצירת שברים, ולא רק מסלקציה מאוחרת של תאים סרטניים. עם זאת, עצם קיומם של שברים באתר מסוים אינו מוכיח שכל שבר יתפתח לטרנסלוקציה או לגידול.

תוצאה שמולידה שאלה חדשה

עם גילוי הפיזור הלא־אקראי של השברים עלתה שאלה חדשה, שלא הייתה שאלת המחקר הראשונית: מה קובע את המיקום הגנומי של השברים שנגרמים על ידי TOP2 ו־Etoposide?

אחת האפשרויות הייתה שהשברים קשורים בעיקר ל־Transcription, משום שרבים מהם אותרו בגנים. אולם בניסויים שהוצגו, עיכוב השעתוק לא ביטל את תבנית השברים, ולכן השעתוק לבדו לא הסביר את הממצאים.

בהמשך נמצא קשר בין אתרי השברים לבין CTCF, חלבון ארכיטקטוני הקשור לארגון הגנום בלולאות (Chromatin loops). נצפתה חפיפה בין אותות CTCF לבין אתרי שברים, ובאמצעות Hi-C, שיטה המתארת קשרים מרחביים בין אזורים שונים בגנום, הודגם קשר בין שברים לבין Loop anchors - נקודות העיגון של הלולאות. לולאות בעלות קשרים חזקים יותר נטו להיות קשורות לרגישות גבוהה יותר לשברים.

מודל האוזניות: מדוע אזורי Loop anchors רגישים לשברים?

המודל שהוצג ממחיש את התופעה באמצעות אוזניות חוטיות שהסתבכו. כשמנסים ליצור או לסדר לולאה בחוט, חלקים אחרים של החוט עשויים להסתבך ולהצטבר בהם מתח. בדומה לכך, ארגון ה־DNA בלולאות עשוי ליצור Topological stress מוגבר בנקודות העיגון. TOP2 מסייע להפחתת המתח הזה באמצעות שברים זמניים מבוקרים, ולכן אותם אזורים עשויים להיות רגישים במיוחד כאשר Etoposide מונע מהאנזים לחבר את השברים בחזרה.

זהו מודל להסברת הקשר שנמצא בין ארגון הגנום לבין מיקום השברים, ולא טענה שכל שבר שנוצר בלולאה יוביל לטרנסלוקציה. הממצא המרכזי למחקר הוא ששאלת מחקר ממוקדת על אזורי שבר התפתחה לשאלה כללית יותר על הקשר בין המבנה התלת־ממדי של הגנום לבין פגיעותו לנזקי DNA.

חלק 4 - מה מלמדים שני מקרי המחקר על ניסוח שאלות?

שני המחקרים מתחילים מאותה נקודת מבט - אי־יציבות גנומית - אבל תהליך יצירת השאלות שונה ביניהם.

עקרונות לניסוח שאלת מחקר טובה

נקודת המבט המחקרית מסייעת לזהות שאלות שבהן לחוקר יש ידע, כלים ויכולת לתרום, אך חשוב לזכור שהידע הנצפה תמיד חלקי. הכרה במגבלה הזאת פותחת אפשרות לשיתופי פעולה עם חוקרים מתחומים אחרים.

פער הידע צריך להיות משמעותי. השאלה אינה נבחרת רק מפני שאפשר לבצע ניסוי, אלא מפני שתשובתו עשויה לקדם את ההבנה בתחום. לפני ניסוח השאלה נדרש בירור מה כבר ידוע בספרות ומה עדיין לא הוכרע.

השאלה צריכה להיבנות באופן שאינו מניח מראש את התשובה. אם עדיין לא ידוע שהחיידק גורם לשינויים כרומוזומליים, אין להתחיל משאלה שכבר מניחה שהם אכן הסיבה לסרטן. לעיתים נדרש שלב מקדים שמבסס את עצם קיומה של התופעה.

שאלות רחבות ניתנות לפירוק לשאלות קטנות, שאפשר לענות עליהן. כל תשובה מחזקת או מחלישה את המסלול המחקרי ומכתיבה את הצעד הבא. אם התשובה לשאלה מוקדמת שלילית, ייתכן שצריך לשנות את הכיוון כולו.

שאלות מחקר אינן קבועות מראש לאורך כל הפרויקט. תוצאה בלתי צפויה, איתור של דפוס חדש או כישלון של הסבר קודם עשויים ליצור שאלה חדשה ואף לשנות את מוקד המחקר. מחקר טוב אינו רק יישום של תוכנית כתובה, אלא גם התאמתה לראיות שנצברות.

חידוש מחקרי וסקירת ספרות

כדי לזהות פער ידע יש לבצע סקירת ספרות (Literature review) ולהכיר את העבודות שכבר התפרסמו ואת הנושאים שנחקרים בתחום. חוקרים עשויים להציג ממצאים בכנסים או לפרסם עבודות כ־Preprints ב־bioRxiv עוד לפני קבלתן לפרסום בכתב עת. לכן גם כאשר בתחילת העבודה נראה שהשאלה חדשה, ייתכן שקבוצה אחרת חוקרת נושא דומה.

המצב שבו קבוצה אחרת מפרסמת תוצאות דומות לפני שהמחקר הושלם מכונה Scooping. במצב כזה ייתכן שהפער המקורי בידע כבר נסגר, ואז צריך לבחון האם לנתונים שנאספו יש עדיין תרומה ייחודית. לעיתים אפשר לשנות את הדגש ולנסח שאלה חדשה שהעבודה האחרת לא ענתה עליה.

מכאן החשיבות של Novelty (חדשנות מחקרית): עד כמה המחקר מוסיף ידע שלא היה קודם, ועד כמה התוספת משמעותית. החדשנות אינה רק שימוש בשיטה חדשה או שינוי קטן בפרוטוקול קיים, אלא הערך של התובנה החדשה ביחס לידע שכבר קיים.

חלק 5 - המשך העבודה בקורס

בפרויקט הקבוצתי נדרש לבחור נושא מחקר, לזהות תצפית או פער ידע ולבנות סביבו שאלת מחקר והצעה מסודרת. חלוקת הקבוצות תימסר במסגרת הקורס. בשלב מוקדם יש להעביר למנחי הקורס את הנושא וכמה שורות המתארות אותו לצורך אישור, ולא להמתין לשבוע שלפני ההצגה. לקראת סיום הסמסטר מתוכננים שני מפגשי הצגת פרויקטים ומפגש סיכום, ולכן קבוצות שונות יציגו במועדים שונים.

לצורך הלמידה חשוב להכיר את שני המחקרים שהוצגו ואת הממצאים המרכזיים שלהם, אך הדגש העיקרי הוא על האופן שבו עוברים מפער ידע לניסוח שאלה, לשאלות המשך ולשינוי הכיוון המחקרי בעקבות התוצאות. זוהי גם המיומנות שתשמש בהמשך הקורס, בעת בניית היפותזה ובחירת השיטה המתאימה לבדיקתה.