שיעור 11 גנטיקה התפתחותית, ריצוף הגנום האנושי וטרנספוזונים

תוכן עניינים:

1. חלק א’: גנטיקה התפתחותית
2. חלק ב’: ריצוף הגנום האנושי
3. חלק ג’: טרנספוזונים (Transposable Elements)
4. חלק ד’: שיטות מחקר גנטי
5. סיכום לבחינה
6. לקסיקון מונחים
7. שאלות תרגול מג׳ונרטות
8. שאלות תרגול מג׳ונרטות: ריצוף DNA וגנומים

חלק א’: גנטיקה התפתחותית

מהי גנטיקה התפתחותית?

גנטיקה התפתחותית היא תחום העוסק באופן שבו גנים משפיעים על תהליכי ההתפתחות העוברית - מתא ביצית מופרה ועד לאורגניזם שלם. המוקד העיקרי הוא בשלבים העובריים המוקדמים, שבהם מתרחשים התהליכים הקריטיים ביותר.

נקודת המוצא: תא ביצית מופרה (זיגוטה) מכיל מידע גנטי משני מקורות - תא ביצית ותא זרע. שני אלה הם תאים הפלואידיים (עותק אחד של הגנום), הידועים גם בשמות:

• גמטות
• תאי מין
• תאי נבט (Germ cells)

כל שאר התאים בגופנו הם תאים סומטיים - תאים דיפלואידיים רגילים.

שלושת התהליכים המרכזיים בהתפתחות עוברית

במהלך ההתפתחות העוברית מתרחשים במקביל שלושה תהליכים קריטיים:

1. חלוקה מוגברת

החלוקה התאית המהירה ביותר בחיינו מתרחשת בשלבים העובריים. התאים מתחלקים בקצב גבוה מאוד כדי להגיע ממספר קטן של תאים למיליארדי תאים בזמן קצר.

דרישות לחלוקה מוגברת:

• אספקת אנרגיה מספקת
• פקטורי גדילה (פנימיים וחיצוניים)
• מעבר מהיר דרך נקודות הבקרה (Checkpoints)

הערה: לאחר ההפריה, כל החלוקות הן מיטוטיות - התא כבר דיפלואידי.

2. התמיינות (Differentiation)

תהליך שבו תאים מקבלים תפקידים ספציפיים - תא אחד הופך לתא לב, אחר לתא עצב, אחר לתא עצם.

מנגנונים המווסתים התמיינות:

• פקטורי שעתוק - רפרסורים שמשתיקים גנים שאינם נדרשים
• אפיגנטיקה - מתילציה על בסיסי C באזורי פרומוטור גורמת להשתקת גנים
• RNAi - מולקולות RNA קצרות שמעכבות mRNA של גנים ספציפיים

מושגי מפתח בפוטנציאל התמיינות:

ככל שתהליך ההתמיינות מתקדם, הפוטנציאל הולך וקטן - יותר גנים מושתקים, פחות אפשרויות נותרות.

3. מורפוגנזה (Morphogenesis)

תהליך יצירת צורת הגוף - לא רק שיהיו תאים מסוגים שונים, אלא שהם יתמקמו במקומות הנכונים ויצרו איברים מאורגנים.

למה צריך צירים? בדיוק כמו שצייר משתמש בקווי עזר, כך התאים צריכים “מערכת קואורדינטות” כדי לדעת:

• מה קדמי ומה אחורי
• מה עליון ומה תחתון
• ימין ושמאל

ללא מורפוגנזה תקינה: גם אם תהליך ההתמיינות מצליח, התאים עלולים להתפזר באופן אקראי - תא לב במקום הראש, תא מוח באזור הבטן.

מורפוגנים ויצירת צירי הגוף

מהם מורפוגנים?

מורפוגנים הם מולקולות סיגנל (בדרך כלל חלבונים) שמופרשות באזורים ספציפיים בעובר ויוצרות גרדיאנט ריכוזים - ריכוז גבוה באזור ההפרשה, וריכוז יורד ככל שמתרחקים.

עקרון הפעולה:

ריכוז גבוה ←――――――――――――――――→ ריכוז נמוך
   ↓                              ↓
ביטוי גן A                    ביטוי גן C
         ↓
      ביטוי גן B

• תאים שקולטים ריכוז גבוה של מורפוגן ← מבטאים קבוצת גנים מסוימת
• תאים שקולטים ריכוז בינוני ← מבטאים קבוצת גנים אחרת
• תאים שקולטים ריכוז נמוך או אפסי ← מבטאים קבוצת גנים שלישית

חשוב: לכל התאים יש רצפטורים לאותו מורפוגן, אבל רמת הסיגנל שנקלטת קובעת איזה גנים יתבטאו.

דוגמה: Bicoid ו־Caudal בזבוב הפירות

בזבוב הפירות (Drosophila), שני מורפוגנים מרכזיים קובעים את ציר ראש־זנב:

סנכרון בין המורפוגנים: חלבון Bicoid מעכב את יצירת חלבון Caudal - כך שבאזור שיש הרבה Bicoid, לא יהיה Caudal, ולהיפך. מנגנון זה מבטיח הפרדה ברורה בין הצירים.

מקור האפקט המטרנלי: mRNA של Bicoid קיים כבר בתא הביצית עוד לפני ההפריה, ממוקם בצד ספציפי - זו נקודת ההתחלה של כל תהליך קביעת הצירים.

גנים הומיאוטיים (Hox Genes) בבני אדם

בבני אדם, גנים הנקראים Hox genes (או גני סגמנטציה) אחראים על קביעת דפוסי הגוף לאורך ציר קדמי-אחורי.

תפקיד: קביעת “גורל” של אזורים שונים בגוף - איזה איברים יתפתחו באיזה אזור.

פגמים בגנים הומיאוטיים: כשיש מוטציה במורפוגנזה, התוצאות הן לרוב לא־לטאליות רק במקרים חלקיים - רוב הפגמים הקשים מובילים להפלה ספונטנית בשליש הראשון של ההריון.

תאי גזע (Stem Cells)

מהם תאי גזע?

תאי גזע הם תאים שעדיין לא סיימו את תהליך ההתמיינות - יש להם פוטנציאל להתחלק ולהתמיין לסוגי תאים שונים.

סוגי תאי גזע

תאי גזע עובריים:

• פוטנציאל התמיינות גבוה (Pluripotent עד Totipotent)
• נמצאים בשלבים מוקדמים של ההתפתחות

תאי גזע בבוגר:

• פוטנציאל מוגבל יותר
• דוגמה מרכזית: תאי גזע במח העצם - יכולים להתחלק לכל סוגי תאי הדם

מה קובע לאן תא גזע יתמיין?

• סיגנלים מהסביבה - מה הרקמה צריכה, מה חסר
• פקטורי גדילה שונים - פקטורים שונים מעודדים התמיינות לכיוונים שונים

חשיבות קלינית של תאי גזע

דם טבורי: מכיל תאי גזע עובריים “צעירים” עם פוטנציאל התמיינות גבוה יותר מתאי גזע בבוגר. כיום נשמר בהקפאה לשימוש עתידי פוטנציאלי.

אפופטוזיס בהתפתחות

גם מוות תאי מתוכנת הוא חלק קריטי מההתפתחות התקינה.

דוגמה קלאסית: האצבעות שלנו נוצרות כ”גוש” אחד, והרווחים ביניהן נוצרים על ידי מוות מתוכנת של התאים באזורים שבין האצבעות.

כשאפופטוזיס לא מתרחש כראוי באזורים הללו, עלולה להיווצר סינדקטיליה (איחוי אצבעות).

חלק ב’: ריצוף הגנום האנושי

רקע - שיטת Sanger לריצוף

שיטת Sanger מבוססת על עקרונות ה־PCR עם תוספת קריטית אחת:

הרכיבים:

• DNA תבנית
• פריימרים ספציפיים
• נוקלאוטידים חופשיים (dNTPs)
• ddNTPs (Dideoxy-nucleotides) - מסומנים פלואורסצנטית
• אנזים Taq polymerase (עמיד בחום)

עקרון הפעולה: ה־ddNTPs דומים לנוקלאוטידים רגילים, אבל לא מסוגלים להתארך בקצה 3’ - כשהם מצטרפים לשרשרת, הסינתזה נעצרת.

התוצאה: בהרבה ריאקציות מקבילות, נוצרים מקטעים בכל האורכים האפשריים - מהקצר ביותר ועד הארוך ביותר. כל מקטע מסומן בצבע לפי הנוקלאוטיד האחרון שלו.

מגבלה קריטית: השיטה מדויקת עד כ־1,000 בסיסים בלבד. מעבר לכך, האיכות יורדת משמעותית.

הבעיה: כיצד לרצף 3 מיליארד בסיסים?

הגנום האנושי מכיל כ־3 מיליארד זוגות בסיסים. עם מגבלת Sanger של ~1,000 bp, נדרשים מיליוני מקטעים - בלתי אפשרי בשיטה ישירה.

שיטה 1: הליכה על גבי הכרומוזום (Chromosome Walking)

העיקרון

1. יצירת ספריות DNA: שבירת הגנום למקטעים באמצעות אנזימי רסטריקציה או גלי קול (סוניקציה), והכנסתם לווקטורים (פלסמידים או פאג’ים) בתוך חיידקים.

2. זיהוי סמנים: שימוש בסמנים גנטיים - רצפי DNA קצרים וייחודיים שמופיעים פעם אחת בגנום (Sequence-Tagged Sites (STS)).

3. הליכה מסמן לסמן:
   • מרצפים מקטע שמכיל סמן ידוע
   • מזהים סמן נוסף במקטע
   • מחפשים מקטע אחר שמכיל את הסמן הזה
   • ממשיכים כך “צעד אחר צעד”
4. בניית קונטיגים (Contigs): חיבור מקטעים שיש ביניהם חפיפה ליצירת רצפים ארוכים יותר.

מה מאפשר את החיבור? חיתוך עם אנזימי רסטריקציה שונים יוצר מקטעים שיש ביניהם אזורים חופפים - כך ניתן לזהות את הסדר הנכון.

חיסרון מרכזי: שיטה איטית מאוד, סיזיפית, דורשת עבודה ידנית רבה.

שיטה 2: Shotgun Sequencing

העיקרון (פותח על ידי חברת Celera)

1. שבירה אקראית: שבירת הגנום למקטעים קצרצרים (1,000-2,000 bp) באמצעות גלי קול - ללא אנזימי רסטריקציה.

2. ריצוף מסיבי: ריצוף של כל המקטעים במקביל.

3. הרכבה חישובית: שימוש במחשבי ענק לזיהוי חפיפות ולבניית הרצף המלא.

יתרונות:

• מהיר יותר משמעותית
• לא דורש זיהוי סמנים מראש
• ניתן לרצף מקטעים רבים במקביל

חיסרון: דורש כוח חישובי עצום

פרויקט הגנום האנושי - המירוץ

הפרויקט הציבורי (2005-1990)

• מימון: NIH וממשלות (18 מדינות, כולל ישראל)
• שיטה: Chromosome Walking
• מטרות:
  1. פענוח רצף 3 מיליארד בסיסים
  2. קביעת מיקום כל רצף
  3. זיהוי מספר הגנים
  4. יצירת מאגר מידע פתוח לציבור
• מקור ה־DNA: 100 מתנדבים מקבוצות אתניות שונות (לא אדם בודד!)

חברת Celera (הפרויקט הפרטי)

• שיטה: Shotgun Sequencing
• יתרון: מהירות גבוהה יותר, עלות נמוכה יותר
• בעיה אתית: חברה פרטית עם אינטרסים מסחריים - סכנה שהמידע הגנטי יהיה בבעלות פרטית

התוצאה

שתי הקבוצות הגיעו לסיום כמעט בו־זמנית. המידע נותר פתוח לציבור.

התקדמות הטכנולוגיה:

• פרויקט מקורי: כ־15 שנים, מיליוני דולרים
• כיום (NGS): פחות מחודשיים, כ־1,000 דולר לאדם

מה גילינו מריצוף הגנום?

הרכב הגנום האנושי

תובנה מפתיעה: רק 1.5% מה־DNA שלנו מקודד לחלבונים! השאר - חלקו בעל תפקיד בקרתי, חלקו שריד אבולוציוני, וחלקו עדיין לא מובן.

מאגר UCSC Genome Browser

לאחר ריצוף הגנום נוצר מאגר מידע מקיף המאפשר:

• צפייה בכל כרומוזום ואזוריו
• זיהוי גנים, אקסונים ואינטרונים
• מיקום SNPs ווריאנטים
• השוואה לגנומים של אורגניזמים אחרים
• מידע על כל נוקלאוטיד בגנום

חלק ג’: טרנספוזונים (Transposable Elements)

IS = Insertion Sequence

מהם טרנספוזונים?

טרנספוזונים הם מקטעי DNA שיכולים לעבור ממקום למקום בתוך הגנום. הם אחד ההסברים המרכזיים לקיום רצפים חזרתיים בגנום.

שני סוגי טרנספוזונים

Class II - DNA Transposons (Cut and Paste)

מנגנון:

1. אנזים טרנספוזאז מזהה את הטרנספוזון
2. האנזים חותך את הטרנספוזון ממקומו המקורי
3. הטרנספוזון משתלב במקום אחר בגנום

Class I - Retrotransposons (Copy and Paste)

מנגנון:

1. הטרנספוזון משועתק ל־RNA
2. אנזים Reverse Transcriptase יוצר cDNA מה־RNA
3. ה־cDNA החדש משתלב במקום אחר בגנום
4. העותק המקורי נשאר במקומו

הבדל קריטי: ב־Cut and Paste יש העברה. ב־Copy and Paste יש שכפול - נוצר עותק נוסף.

משמעות אבולוציונית

תרומות פוטנציאליות:

• יצירת עותקים של גנים חשובים - “גיבוי” גנטי
• שינוי בקרה - גן שעובר מקום עשוי להיות תחת בקרה שונה
• הגברת שונות גנטית - מנגנון לשינוי מהיר יחסית

סיכונים:

• השתלבות בתוך גן פעיל עלולה לשבש אותו
• עלול לגרום למוטציות מזיקות

קצב התנועה: טרנספוזונים לא נעים כל הזמן - התנועה יכולה להתרחש בתדירות נמוכה מאוד (פעם בדורות רבים).

שימוש במחקר

חוקרים משתמשים בטרנספוזונים ככלי מחקר:

• יצירת מוטציות מכוונות - הכנסת טרנספוזונים לגנים ספציפיים
• מעקב אחר ביטוי גנים - הוספת סמנים (כמו GFP) לטרנספוזון
• פוטנציאל לטיפול גנטי - הכנסת גנים תרפויטיים

חלק ד’: שיטות מחקר גנטי

Forward vs. Reverse Genetics

Forward Genetics

כיוון: מפנוטיפ ← לגנוטיפ

השאלה: יש לי תופעה/מחלה - איזה גן אחראי?

שיטות:

• השוואת רצפים בין קבוצות (חולים vs. בריאים)
• מחקרי GWAS (Genome-Wide Association Studies)

Reverse Genetics

כיוון: מגנוטיפ ← לפנוטיפ

השאלה: יש לי גן - מה הוא עושה?

שיטות:

• Knockout - השבתת גן ובדיקת ההשפעה
• מוטגנזה מכוונת - יצירת מוטציות בגנים ספציפיים
• שימוש בטרנספוזונים - הכנסה אקראית ומעקב אחר פנוטיפים
• ביטוי יתר - הגברת ביטוי של גן ובדיקת ההשפעה

מחקרי GWAS

מהו GWAS? Genome-Wide Association Study - מחקר שמשווה את כל הגנום בין קבוצות גדולות.

העיקרון:

1. איסוף קבוצה גדולה של אנשים עם מאפיין/מחלה מסוימים
2. איסוף קבוצת ביקורת (ללא המאפיין)
3. ריצוף/סריקת הגנום של כל המשתתפים
4. זיהוי אזורים גנטיים שונים באופן מובהק בין הקבוצות

למה צריך קבוצות גדולות? כי יש הרבה שונות “רגילה” בין אנשים - צריך מספיק נבדקים כדי להבחין בין שונות אקראית לבין שונות הקשורה למאפיין הנחקר.

פרויקט 1,000 Genomes

תקופה: 2015-2008

מטרות:

1. בניית מפה מפורטת של שונות גנטית באוכלוסייה
2. זיהוי מוטציות הגורמות למחלות
3. הבנת שינויים אבולוציוניים בגנום האנושי

ממצאים:

• זוהו כ־2,000 לוקוסים הקשורים ל־300+ מחלות
• בממוצע, לכל אדם 300-250 וריאנטים הגורמים לאובדן פעילות של אלל אחד
• קצב המוטציות בדורות גבוה ממה שחשבו

סיכום לבחינה

גנטיקה התפתחותית

• שלושה תהליכים מקבילים: חלוקה מוגברת, התמיינות, מורפוגנזה
• מורפוגנים: חלבונים שמופרשים ויוצרים גרדיאנט ריכוזים; רמות שונות מפעילות גנים שונים
• Bicoid - מורפוגן ראש; Caudal - מורפוגן זנב (בזבוב)
• Hox genes - גנים הומיאוטיים בבני אדם לקביעת צירי הגוף
• פוטנציאל התמיינות: Totipotent > Pluripotent > Multipotent > Tissue-specific
• תאי גזע בבוגר: מח עצם - יכולים להתחלק לכל תאי הדם

ריצוף הגנום

• Sanger: מדויק עד ~1,000 bp בלבד
• Chromosome Walking: איטי, מבוסס סמנים וחפיפות
• Shotgun Sequencing: מהיר, מבוסס חישוב
• פרויקט הגנום: 2005-1990, 100 מתנדבים, מידע פתוח לציבור
• הרכב הגנום: רק 1.5% מקודד, ~60% רצפים חזרתיים

טרנספוזונים

• Class I (Retrotransposons): Copy and Paste דרך RNA
• Class II (DNA Transposons): Cut and Paste ישיר
• משמעות: הסבר לרצפים חזרתיים, מנגנון אבולוציוני

שיטות מחקר

• Forward Genetics: פנוטיפ ← גנוטיפ (GWAS)
• Reverse Genetics: גנוטיפ ← פנוטיפ (Knockout, מוטגנזה)
• GWAS: השוואת גנום בין קבוצות גדולות

לקסיקון מונחים

שאלות תרגול מג׳ונרטות

שאלה 1: שלבי ההתפתחות העוברית

מהם שלושת השלבים המרכזיים בהתפתחות עוברית?

1. חלוקה תאית (Cleavage), גסטרולציה (Gastrulation), נוירולציה (Neurulation)
2. חלוקה תאית (ריבוי תאים), דיפרנציאציה (התמיינות תאים), מורפוגנזה (עיצוב הגוף)
3. מיוזה (יצירת גמטות), הפריה (יצירת זיגוטה), אורגנוגנזה (יצירת איברים)
4. דיפרנציאציה (התמיינות), אורגנוגנזה (איברים), גדילה (Growth) עד שלב הלידה

שאלה 2: מהזיגוטה לבלסטוציסט

מהו ה־Inner Cell Mass בבלסטוציסט, ומה משמעותו?

1. שכבת תאים פנימית שמייצרת בעיקר את שק החלמון ורקמות תומכות עובר
2. שכבת תאים חיצונית שממנה יתפתחו רוב תאי הגוף, בעוד התאים הפנימיים יוצרים שליה
3. צבר התאים הפנימיים שממנו יתפתחו תאי גזע פלוריפוטנטיים ובהמשך מרבית תאי העובר
4. חלל הבלסטוציסט (Blastocoel) שמכיל נוזל ותפקידו לאפשר דיפוזיה של מורפוגנים

שאלה 3: טוטיפוטנטיות מול פלוריפוטנטיות

מה ההבדל בין תא טוטיפוטנטי לתא פלוריפוטנטי?

1. טוטיפוטנטי יוצר רק רקמות חוץ־עובריות (כמו שליה), ופלוריפוטנטי יוצר רק רקמות עובריות (תאי גוף)
2. טוטיפוטנטי יכול ליצור אורגניזם שלם כולל רקמות חוץ־עובריות; פלוריפוטנטי יוצר את רוב תאי הגוף אך לא שליה
3. טוטיפוטנטי הוא תא גזע בוגר (Adult stem cell), ופלוריפוטנטי נמצא רק בשלבי חלוקה מאוחרים של העובר
4. טוטיפוטנטי ופלוריפוטנטי מתארים אותו דבר, ההבדל הוא רק במידת קצב החלוקה של התאים

שאלה 4: שלוש שכבות הנבט

רקמת מערכת העצבים (עצבים) ורקמת האפידרמיס (עור) מתפתחות משכבת נבט אחת. מהי?

1. אקטודרם - שכבת נבט שתורמת בין היתר למערכת העצבים ולאפידרמיס
2. מזודרם - שכבה שמייצרת שריר/שלד וגם חלקים של מערכת העצבים ההיקפית
3. אנדודרם - שכבה פנימית שמייצרת אפיתל נשימתי ומערכת העיכול וגם עור
4. טרופובלסט - שכבה עוברית שממנה מתפתחות שכבות הנבט והרקמות החוץ־עובריות יחד

שאלה 5: גסטרולציה

מהי גסטרולציה ומה נוצר בתהליך זה?

1. שלב מעבר שבו הבלסטולה עוברת ארגון מחדש ונוצרות שכבות נבט עיקריות שמגדירות את תוכנית הגוף
2. שלב חלוקות מוקדמות שבו הזיגוטה מתחלקת לתאי Blastomeres ונוצר כדור תאים ראשוני
3. שלב שבו מתחילה נוירולציה ונוצרת התחלה של Neural Tube לאורך ציר הגוף
4. שלב שבו מתחילה אורגנוגנזה מוקדמת ונוצרים ניצני איברים (כמו לב, כבד ומעי)

שאלה 6: קוטביות Anterior-Posterior

איזו קוטביות נקבעת עוד בשלב הביצית בדרוזופילה, וכיצד?

1. קוטביות Anterior–Posterior נקבעת מוקדם ע”י לוקליזציה של mRNA אימהי בקוטב הקדמי ויצירת גרדיאנט חלבון לאחר ההפריה
2. קוטביות Dorsal–Ventral נקבעת בביצית ע”י גרדיאנט Wnt שמופרש מהקוטב האחורי ומדכא גנים דורסליים
3. קוטביות Right–Left נקבעת בביצית ע”י תנועת סיליות שמסיטות מורפוגנים לצד שמאל עוד לפני הפריה
4. אין קוטביות בביצית; כל הצירים נקבעים רק לאחר חלוקת תאים והופעת שכבות הנבט

שאלה 7: מורפוגנים - עקרון הפעולה

כיצד מורפוגן קובע גורלות תאיים שונים באותו רקמה?

1. מורפוגן מופרש מנקודת מקור ויוצר גרדיאנט; תאים מפרשים ריכוזים שונים ומפעילים סטים שונים של גנים בהתאם לספים
2. מורפוגן נקשר ל־DNA בכל תא באופן זהה, אך גורם לאותם גנים לפעול בזמן שונה בכל אזור ברקמה
3. מורפוגן נכנס רק לתאי גזע; תאים ממוינים אינם מגיבים ולכן נוצר דפוס מרחבי עקיף
4. מורפוגן גורם בעיקר למוות תאי של תאים רחוקים מהמקור וכך נוצר גבול רקמתי חד

שאלה 8: Bicoid כמורפוגן ומווסת תרגום

חלבון Bicoid פועל בשני מנגנונים שונים. מהם?

1. פועל כמפעיל שעתוק של גנים אנטריוריים וגם כמעכב תרגום של caudal mRNA באזור הקדמי
2. פועל כמפעיל שעתוק של caudal באזור פוסטריור וגם כמעכב תרגום של hunchback באזור אנטריור
3. פועל כ־Receptor ממברנלי שמפעיל מסלול איתות וגם כאנזים שמפרק mRNA בציטופלזמה
4. פועל כמעכב שעתוק של גנים אנטריוריים וגם כמעכב תרגום של bicoid mRNA באמצעות משוב שלילי

שאלה 9: Syncytial Blastoderm בדרוזופילה

מדוע ההתפתחות המוקדמת של דרוזופילה ייחודית בהשוואה ליונקים?

1. חלוקות גרעיניות מהירות מתרחשות ללא ציטוקינזיס, ולכן נוצר syncytium עד שלב שבו נוצרת ממברנה סביב כל גרעין
2. חלוקות תאים מוקדמות מתרחשות רק לאחר יצירת שכבות נבט, ולכן אין שלב של blastula אמיתי
3. ההתפתחות מתבססת על מיוזה חוזרת של גרעינים ללא הפריה, ולכן נוצר עובר הפלואידי זמני
4. אין מורפוגנים בדרוזופילה; דפוס הגוף נקבע רק ע”י אינטראקציות בין תאים לאחר cellularization

שאלה 10: Maternal Effect Genes

אם לזבוב (דרוזופילה) נקבה יש מוטציה הומוזיגוטית בגן Bicoid - מה צפוי לקרות?

1. הנקבה תיראה תקינה, אך העוברים שלה יפתחו חסר במבנים אנטריוריים עקב היעדר אספקת mRNA אימהי לביצית
2. הנקבה עצמה תהיה חסרת מבנים אנטריוריים, כי Bicoid נדרש להתפתחות ראש אצל כל פרט
3. העוברים יהיו תקינים כי הגנום של האב מספק Bicoid מוקדם ומאזן את החסר האימהי
4. הנקבה תהיה עקרה תמיד, כי בלי Bicoid לא מתרחשת הפריה או התחלת חלוקות גרעין

שאלה 11: גני סגמנטציה

מהו תפקידם של גני סגמנטציה (Segmentation genes)?

1. כיוון יצירת סגמנטים ומיקומם לאחר שהוגדרו הצירים המרכזיים של העובר ע”י גנים אימהיים
2. קביעת ציר Anterior–Posterior הראשוני באמצעות גרדיאנט של מורפוגנים אימהיים בביצית
3. קביעת זהות סגמנטלית (ראש/חזה/בטן; אנטנה/רגל/כנף) לאחר שהסגמנטים כבר קיימים
4. יצירת שלוש שכבות הנבט בתהליך הגסטרולציה וקביעת גורל רקמות מרכזיות

שאלה 12: גנים הומיאוטיים - Homeotic Genes

מהו גן הומיאוטי ומה קורה כשיש בו מוטציה?

1. גן שמגדיר את זהות הסגמנט ואת סוג המבנים שיתפתחו בו; מוטציה יכולה לגרום להחלפת איבר באיבר אחר במיקום שגוי
2. גן שמגדיל את קצב חלוקת התאים בכל העובר; מוטציה גורמת לעיכוב כללי בהתפתחות ולגדילה איטית
3. גן שמווסת יצירת שכבות נבט בגסטרולציה; מוטציה גורמת להיעדר מוחלט של מזודרם
4. גן שמקודד לאנזים מטבולי בסיסי; מוטציה גורמת לכשל מטבולי כלל־גופי אך לא לשינוי מבני

שאלה 13: גני Hox - שימור אבולוציוני

כמה אשכולות (clusters) של גני Hox קיימים באדם, והיכן הם ממוקמים?

1. ארבעה אשכולות (HOX A–D) על כרומוזומים שונים; יש גם עקרון קולינאריות בין סדר הגנים לבין ציר הגוף
2. אשכול יחיד גדול על כרומוזום אחד; הסדר הפנימי שלו אינו קשור לדפוס הביטוי העוברי
3. שני אשכולות עיקריים על כרומוזומי המין; הם אחראים בעיקר לדימורפיזם מיני בעובר
4. אשכולות רבים מפוזרים באופן אקראי בגנום; כל גן Hox פועל ללא קשר לשכניו בכרומוזום

שאלה 14: מסלול Sonic Hedgehog - Shh

מהו תפקידו של מסלול Shh ואיזו מחלה נגרמת ממוטציה בו?

1. התפתחות המוח והגפיים; פגיעה במסלול עלולה לגרום ל־Holoprosencephaly עקב כשל בדפוס מוקדם של המוח הקדמי
2. ויסות חלוקת תאי דם; מוטציה גורמת ל־Anemia חרמשית עקב שינוי בהמוגלובין
3. בניית סחוס וגדילת עצם ארוכה; מוטציה גורמת ל־Achondroplasia עקב FGFR3 פעיל־יתר
4. התפתחות מערכת החיסון; מוטציה גורמת ל־SCID עקב כשל בהבשלה של לימפוציטים

שאלה 15: פקטורי שעתוק מרכזיים בהתמיינות

אילו פקטורי שעתוק חשובים לשמירה על פלוריפוטנטיות של תאי גזע?

1. Sox2 ו־Oct4 - רשת רגולטורית שמייצבת פלוריפוטנטיות ומונעת התמיינות מוקדמת
2. p53 ו־Rb - בקרה על מחזור התא ומניעת חלוקה לא מבוקרת ברקמות שונות
3. MyoD ו־Myogenin - שפעול תוכנית התמיינות שרירית ויצירת סיבי שריר
4. HoxA ו־HoxD - קביעת זהות סגמנטלית לאורך ציר הגוף בעובר

שאלה 16: אפופטוזיס בהתפתחות

מדוע מוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס) הכרחי להתפתחות עוברית תקינה?

1. אפופטוזיס מאפשר “פיסול” של רקמות ע”י סילוק תאים במיקום וזמן מדויקים; כשל בו גורם למשל לסינדקטיליה
2. אפופטוזיס נדרש רק כדי להשמיד תאים שעברו מוטציות, ולכן רלוונטי בעיקר למניעת סרטן בעובר
3. אפופטוזיס הוא מנגנון שמאיץ חלוקת תאים ע”י שחרור גורמי גדילה מהתאים המתים לסביבה
4. אפופטוזיס מחליף דיפרנציאציה: תאים שאינם מתים נשארים תאי גזע ולכן מבנים נוצרים נכון

שאלה 17: תסמונת מרפן (Marfan Syndrome)

מהו הפגם הגנטי בתסמונת מרפן ואילו מערכות מושפעות?

1. מוטציה ב־FBN1 (פיברילין-1); פגיעה ברקמות חיבור עם ביטוי בשלד, עיניים, ריאות ולב וכלי דם
2. מוטציה ב־CFTR; פגיעה בהפרשת כלוריד שגורמת למחלה רב־מערכתית עם דגש על ריאות ולבלב
3. מוטציה ב־COL1A1; פגיעה בקולגן סוג I שמובילה לשברים חוזרים ועיוותי שלד
4. מוטציה ב־FGFR3; אות יתר שמדכא גדילת עצם ארוכה וגורם לגמדות

שאלה 18: ההיררכיה הגנטית בדרוזופילה

מהו הסדר הנכון של ההיררכיה הגנטית בהתפתחות דרוזופילה?

1. Maternal effect genes קובעים צירים, אחריהם Segmentation genes מחלקים לסגמנטים, ולבסוף Homeotic genes מגדירים זהות סגמנט
2. Segmentation genes קובעים צירים ראשוניים, אחריהם Homeotic genes בונים סגמנטים, ולבסוף Maternal effect genes מייצבים זהות
3. Homeotic genes פועלים ראשונים לקביעת זהות, אחריהם Maternal effect genes יוצרים גרדיאנטים, ולבסוף Segmentation genes מחלקים
4. Maternal effect genes קובעים זהות סגמנטלית, Segmentation genes קובעים איברים, Homeotic genes קובעים קוטביות A–P

שאלה 19: מחקר תאי גזע - חשיבות רפואית

מדוע יש עניין רב במחקר תאי גזע?

1. כי הם מאפשרים רגנרציה/החלפה של תאים ורקמות ובכך פוטנציאל טיפולי במחלות ניווניות, פגיעות לב וסוכרת
2. כי הם מתחלקים במהירות ולכן תמיד ניתן לייצר מהם כל רקמה בלי בעיות התאמה חיסונית
3. כי שימוש בתאי גזע מתאים רק למחקר בסיסי ואינו רלוונטי לרפואה יישומית או תרפיה
4. כי תאי גזע משמשים בעיקר לאבחון גנטי (screening) ואין להם שימושים קליניים עתידיים

שאלה 20: אינטגרציה - מוטציה בגן התפתחותי

חוקרת מזהה עובר דרוזופילה עם פנוטיפ שבו רגליים גדלות מאזור הראש במקום אנטנות. על מוטציה באיזה סוג גן מדובר, ומדוע?

1. Homeotic gene - כי הסגמנט קיים אך הזהות השתנתה, ונוצרה “המרה הומיאוטית” (appendage swap)
2. Maternal effect gene - כי פגיעה מוקדמת בצירים גורמת לכך שמבנים אנטריוריים מתפתחים כפוסטריוריים
3. Pair-rule gene - כי חסר סגמנט חלופי מוביל לפיצוי שבו הראש “מפתח” איברים של החזה
4. Gap gene - כי חסר רציף של סגמנטים משנה את מספר האיברים ולכן נוצרת רגל במקום אנטנה

שאלות תרגול מג׳ונרטות: ריצוף DNA וגנומים

נושאים:

• שיטת Sanger ו־ddNTPs
• אלקטרופורזה קפילרית
• וקטורים וספריות גנומיות
• Chromosome Walking מול Shotgun
• פרויקט הגנום האנושי
• הרכב הגנום (1.5% מקודד!)
• סוגי חזרות
• טרנספוזונים (Copy+Paste מול Cut+Paste)
• Reverse Transcriptase ו־cDNA
• עכברי Knockout
• P-element ו־Inverse PCR
• NGS עם Bridge Amplification
• GWAS
• 1000 Genomes
• וגנומיקה השוואתית

שאלה 1: עקרון ריצוף Sanger

מדוע ddNTPs (Dideoxynucleotide triphosphates) גורמים לעצירת סינתזת DNA?

1. הם נקשרים לתבנית ה־DNA ומונעים מהפולימרז להמשיך את האלונגציה
2. הם חסרים קבוצת 3’-OH (ובהם גם 2’ הוא H), ולכן לאחר שילובם אין אפשרות להוסיף נוקלאוטיד נוסף בקשר פוספודיאסטרי
3. הם גורמים ל־DNA polymerase לשגיאות זיווג בסיסים שמפסיקות את הריאקציה באופן אקראי
4. הם משנים את מבנה ה־DNA כך שהוא מפסיק לשמש כתבנית לקשירת פריימר

שאלה 2: ריאקציית Sanger - עקרון הריצוף

בריאקציית ריצוף Sanger מודרנית, כיצד מזהים באיזה נוקלאוטיד נעצרה כל שרשרת?

1. ע”י פריימר מסומן פלואורסנטית, והצבע משתנה בהתאם לבסיס הבא בתבנית
2. ע”י הרצה בארבע תעלות נפרדות (אחת לכל בסיס) ובניית הרצף לפי גובה הלהקות
3. ע”י סימון פלואורסנטי שונה לכל ddNTP, כך שכל מקטע “מדווח” על הבסיס המסיים שלו בזמן המעבר בדטקטור
4. ע”י מדידה ישירה של מסה מולקולרית לכל מקטע כדי להסיק איזה ddNTP שולב בסוף

שאלה 3: קריאת כרומטוגרמה

בריצוף Sanger אוטומטי, נקבל כרומטוגרמה עם פיקים בצבעים שונים. מה המשמעות כאשר סמוך לסוף הריאקציה מופיעים פיקים חופפים ולא ברורים?

1. מדובר בהכרח בזיהום דגימה, ולכן יש למחוק את כל תוצאות הריצה
2. איכות ההפרדה יורדת בסוף הקריאה, ולכן לעיתים הבסיס מסומן כ־N כאשר לא ניתן להכריע בין פיקים
3. זה מעיד תמיד על הטרוזיגוטיות בבסיס האחרון שנקרא, גם אם אין פיקים כפולים לפני כן
4. זו הוכחה שהפריימר נקשר באתר שגוי, ולכן אי אפשר לקבל שום קריאה אמינה מהריצה

שאלה 4: Capillary Electrophoresis מול ג’ל

מהם היתרונות של אלקטרופורזה קפילרית (CE) על פני ג’ל ריצוף מסורתי?

1. CE מאפשרת הפרדה ברזולוציה גבוהה של מקטעים קצרים מאוד ולכן מפחיתה חפיפות פיקים, אך זמן הריצה דומה לג’ל ודורש כמויות DNA דומות
2. CE מקצרת זמן ריצה ודורשת פחות DNA; הזיהוי נעשה בפלואורסנציה במקום צביעה בג’ל מסורתי
3. CE זולה יותר מכל שיטה אחרת אך דורשת יותר DNA כדי לקבל אות יציב
4. CE מאפשרת להריץ מספר גדול של דגימות באותו קפילר באותו זמן, כמו “מולטי-ליין” בג’ל

שאלה 5: וקטורים לספריות גנומיות

חוקרת רוצה לשבט מקטע DNA בגודל 200 Kb. איזה וקטור מתאים לה?

1. BAC (טווח אופייני ~150–350 Kb), מתאים לשיבוט מקטעים גדולים בסדר גודל של מאות Kb
2. קוסמיד (טווח אופייני ~35–45 Kb), מתאים למקטעים בינוניים אך לא למאות Kb
3. פאג’ לאמדא (טווח אופייני ~20–25 Kb), שימושי לספריות קטנות יחסית
4. פלסמיד רגיל (טווח אופייני ~5–20 Kb), נוח לעבודה אך מוגבל מאוד בגודל אינסרציה

שאלה 6: Chromosome Walking ו־Contigs

מהו Contig ומה תפקידו בריצוף גנומי?

1. מקטע DNA קצר “מתויג” (STS) שמשמש נקודת עגינה ידועה להתקדמות לאורך כרומוזום
2. קבוצת שכפולים (clones/reads) עם חפיפה שמורכבת לרצף רציף ארוך יותר ומשמשת לבניית רצף גנומי
3. וקטור שיבוט גדול (כמו BAC/YAC) שנושא מקטעי גנום לשם ריצוף
4. אנזים עזר שמאפשר ליגציה יעילה של מקטעים ליצירת ספריה גנומית

שאלה 7: פרויקט הגנום האנושי - מטרות

איזו מהאפשרויות הבאות לא הייתה מטרה מוצהרת של פרויקט הגנום האנושי?

1. בניית מאגרי מידע וכלים חישוביים לאחסון וניתוח רצפים בהיקף עצום
2. זיהוי ומיפוי של גנים ורצפים בגנום האנושי לצד קבלת רצף ייחוס מלא
3. פיתוח תרופות מותאמות אישית על בסיס מידע גנומי
4. פענוח רצף הבסיסים של הגנום האנושי והנגשתו לקהילה המדעית

שאלה 8: Whole Genome Shotgun Sequencing

מהו העיקרון של שיטת Shotgun Sequencing?

1. התקדמות ליניארית לאורך כרומוזום באמצעות STS ו־“walking” בין שכפולים חופפים שנבחרו מראש
2. פירוק אקראי של הגנום למקטעים רבים, ריצוף “reads” חופפים, והרכבת הרצף חישובית על בסיס חפיפות
3. ריצוף של מקטעים ארוכים בלבד (≥150 Kb) כדי לצמצם בעיות חזרות ולבטל צורך באלגוריתמי הרכבה
4. החדרה של כל הגנום לוקטור יחיד גדול, ריצופו ברצף, ואז חיתוך לתתי-רצפים לנוחות ניתוח

שאלה 9: השוואת שיטות - Chromosome Walking מול Shotgun

מהו החיסרון המרכזי של שיטת ה־Shotgun ביחס לרצפי חזרות בגנום?

1. רצפים חוזרים מונעים יצירת קצוות חופפים ולכן לא נוצרים contigs כלל
2. רצפים חוזרים מקשים על Assembly כי “reads” מאזורים שונים נראים זהים ולכן קשה למקם אותם נכון
3. אנזימי רסטריקציה אינם חותכים בתוך חזרות ולכן אי אפשר לפרק גנום עם חזרות למקטעים לריצוף
4. רצפים חוזרים גורמים לעלייה בתוכן GC ולכן הפולימרז נתקע באלקטרופורזה הקפילרית

שאלה 10: הרכב הגנום האנושי

כמה אחוז מהגנום האנושי מקודד בפועל לחלבונים ו־RNA?

1. כ־15% - רצפים לא־מקודדים ייחודיים שאינם חזרתיים
2. כ־24% - אינטרונים שמצויים בתוך גנים אך אינם מתורגמים
3. כ־1.5% - אקסונים שמקודדים לחלבון וגם גנים ל־rRNA/tRNA
4. כ־59.5% - רצפים חזרתיים (כמו טרנספוזונים ואלמנטים חוזרים אחרים)

שאלה 11: סוגי רצפי חזרות בגנום

מהם Microsatellites (STRs) וכיצד הם שונים מ־Minisatellites (VNTRs)?

1. STRs הם חזרות של מאות בסיסים ($100–1,000\,\mathrm{bp}$); VNTRs הם חזרות של $13–100 \, \mathrm{bp}$ בלבד
2. STRs הם חזרות קצרות מאוד (יחידת חזרה <13bp); VNTRs הם חזרות ארוכות יותר ($\approx 13–100 \, \mathrm{bp}$) במספר חזרות משתנה
3. STRs ו־VNTRs זהים בגודל יחידת החזרה; ההבדל הוא רק אם הם נמצאים באקסונים או באינטרונים
4. STRs נמצאים כמעט רק בכרומוזום X; VNTRs כמעט רק בכרומוזומים אוטוזומליים

שאלה 12: טרנספוזונים - סוגים ומנגנונים

מה ההבדל בין רטרוטרנספוזון (Class 1) לבין טרנספוזון DNA (Class 2)?

1. רטרוטרנספוזון “Cut+Paste” ומשאיר אתר ריק; טרנספוזון DNA “Copy+Paste” ומגדיל עותקים
2. רטרוטרנספוזון “Copy+Paste” דרך מתווך RNA ו־Reverse Transcription; טרנספוזון DNA “Cut+Paste” בעזרת טרנספוזאז
3. שניהם “Copy+Paste”, אך רטרוטרנספוזון פועל רק באקסונים וטרנספוזון DNA רק באינטרונים
4. שניהם “Cut+Paste”, אך ההבדל הוא רק בגודל הטרנספוזון ולא במנגנון

שאלה 13: Reverse Transcriptase ושימושיו

מי משתמש באנזים Reverse Transcriptase באופן טבעי, ומדוע הוא חשוב במעבדה?

1. חיידקים משתמשים בו ליצירת פלסמידים מ־RNA; במעבדה הוא משמש לריצוף Sanger
2. רטרו־וירוסים ורטרוטרנספוזונים משתמשים בו ליצירת DNA מ־RNA; במעבדה משתמשים בו ליצירת cDNA ול־RT-PCR
3. תאי גוף משתמשים בו בשכפול כרומוזומים; במעבדה הוא מחליף DNA פולימרז ב־PCR
4. תאי גזע בלבד משתמשים בו לרגנרציה; במעבדה הוא משמש בעיקר לעריכת גנים בעוברים

שאלה 14: cDNA מול DNA גנומי

מדוע cDNA שנוצר מ־mRNA שונה מה־DNA הגנומי המקורי?

1. cDNA מכיל U במקום T ולכן רצפו שונה מה־DNA הגנומי
2. cDNA משקף mRNA שעבר שחבור, ולכן הוא מורכב מאקסונים מחוברים ללא אינטרונים
3. cDNA אינו יכול להפוך לדו־גדילי ולכן לא ניתן לבצע עליו PCR או שיבוט
4. cDNA תמיד ארוך יותר כי הוא כולל את רצפי הפרומוטור ואת זנב ה־Poly-A

שאלה 15: יצירת עכברי Knockout

מהו הסדר הנכון של השלבים ביצירת עכבר Knockout?

1. הכלאה בין הורים מוטנטים ← סלקציה של צאצאים ← רקומבינציה בתאי מין ← החדרה לעובר
2. החדרת DNA לתאי ES (לרוב באלקטרופורציה) ← רקומבינציה הומולוגית ← סלקציה באנטיביוטיקה ← החדרה לעובר ← יצירת עכבר כימרי
3. עריכת הגן בעזרת אנזימי רסטריקציה ← ליגציה של גן עמידות ← הזרקה ישירה לעובר ← כימרה
4. מיפוי הגן ← מחיקה כימית של האקסונים ← שכפול במבחנה ← השתלה בביצית ← לידה

שאלה 16: P-element בדרוזופילה

כיצד מופרד מערכת ה־P-element לשני חלקים כדי לאפשר שליטה בהכנסת גן זר?

1. חותכים את ה־P-element לשני חצאים שווים כדי למנוע אינטגרציה לא מבוקרת
2. מקודדים טרנספוזאז בנפרד ללא רצפי ההכרה, ומשאירים את רצפי ההכרה + גן מדווח על P-plasmid; טרנספוזיציה מתרחשת רק כששניהם יחד
3. מפרידים את הפרומוטור מהגן הזר כדי לשלוט בביטוי לאחר אינטגרציה
4. משתיקים את הטרנספוזאז ע”י RNAi ומפעילים אותו רק לאחר שהגן כבר השתלב בגנום

שאלה 17: Inverse PCR - זיהוי מיקום הטרנספוזון

כיצד מזהים היכן בגנום הוכנס ה־P-element?

1. מזהים את מקום ההכנסה לפי רמת הביטוי של הגן המדווח ב־Western blot
2. מבצעים Southern blot עם גלאים לכל כרומוזום כדי לראות באיזה כרומוזום יש להקה חזקה יותר
3. חותכים DNA באנזים שחותך גם בתוך הטרנספוזון, מבצעים ליגציה עצמית למעגלים, עושים PCR עם פריימרים הפונים החוצה מתוך הטרנספוזון, ואז מרצפים את התוצר
4. מרצפים את כל הגנום ב־NGS ומחפשים בדיעבד את רצף ה־P-element בכל ה־reads

שאלה 18: NGS - Bridge Amplification

מדוע נדרש שלב של Bridge Amplification לפני הריצוף בשיטת Illumina?

1. כדי להוסיף אדפטורים דו־צדדיים למקטעים לפני הקשירה לפלטפורמה
2. כדי להגדיל את מספר העותקים בכל אתר על ה־flow cell ולייצר אות פלואורסנטי חזק מספיק לקריאה במהלך הריצוף
3. כדי למיין את מקטעי ה־DNA לפי אורך, כך שכל cluster יכיל מקטעים באותו גודל
4. כדי לתקן שגיאות שנוצרו בסוניקציה באמצעות אנזימי proofreading לפני תחילת הריצוף

שאלה 19: GWAS ותוצאות 1000 Genomes

על פי תוצאות פרויקט 1000 Genomes, כמה וריאנטים הגורמים לאובדן תפקוד (loss-of-function) נושא כל אדם בממוצע?

1. כ־50–100 וריאנטים
2. כ־5–10 וריאנטים
3. כ־250–300 וריאנטים
4. כ־1,000–2,000 וריאנטים

שאלה 20: גנומיקה השוואתית ואבולוציה

הזהות בגנום בין אדם לשימפנזה היא 99.4%, ובכל זאת הם שונים מאוד פנוטיפית. מהו ההסבר העיקרי?

1. השימפנזה מכיל מספר גדול של גנים שאין לאדם ולכן ההבדל הוא בעיקר בכמות הגנים
2. ההבדלים נובעים בעיקר מהבדלים במספר הכרומוזומים ולא מתכנים גנטיים אחרים
3. מרבית ההבדלים המשמעותיים הם ברגולציה של ביטוי גנים (מתי/איפה/כמה), ולא רק בשינויי רצף באקסונים
4. ההבדלים הם כמעט רק תוצאה של גורמים סביבתיים; ברמה המולקולרית אין פערי תפקוד