שיעור 11 גנטיקה התפתחותית, ריצוף הגנום האנושי וטרנספוזונים

חלק א’: גנטיקה התפתחותית

מהי גנטיקה התפתחותית?

גנטיקה התפתחותית היא תחום העוסק באופן שבו גנים משפיעים על תהליכי ההתפתחות העוברית - מתא ביצית מופרה ועד לאורגניזם שלם. המוקד העיקרי הוא בשלבים העובריים המוקדמים, שבהם מתרחשים התהליכים הקריטיים ביותר.

נקודת המוצא: תא ביצית מופרה (זיגוטה) מכיל מידע גנטי משני מקורות - תא ביצית ותא זרע. שני אלה הם תאים הפלואידיים (עותק אחד של הגנום), הידועים גם בשמות:

• גמטות
• תאי מין
• תאי נבט (Germ cells)

כל שאר התאים בגופנו הם תאים סומטיים - תאים דיפלואידיים רגילים.

שלושת התהליכים המרכזיים בהתפתחות עוברית

במהלך ההתפתחות העוברית מתרחשים במקביל שלושה תהליכים קריטיים:

1. חלוקה מוגברת

החלוקה התאית המהירה ביותר בחיינו מתרחשת בשלבים העובריים. התאים מתחלקים בקצב גבוה מאוד כדי להגיע ממספר קטן של תאים למיליארדי תאים בזמן קצר.

דרישות לחלוקה מוגברת:

• אספקת אנרגיה מספקת
• פקטורי גדילה (פנימיים וחיצוניים)
• מעבר מהיר דרך נקודות הבקרה (Checkpoints)

הערה: לאחר ההפריה, כל החלוקות הן מיטוטיות - התא כבר דיפלואידי.

2. התמיינות (Differentiation)

תהליך שבו תאים מקבלים תפקידים ספציפיים - תא אחד הופך לתא לב, אחר לתא עצב, אחר לתא עצם.

מנגנונים המווסתים התמיינות:

• פקטורי שעתוק - רפרסורים שמשתיקים גנים שאינם נדרשים
• אפיגנטיקה - מתילציה על בסיסי C באזורי פרומוטור גורמת להשתקת גנים
• RNAi - מולקולות RNA קצרות שמעכבות mRNA של גנים ספציפיים

מושגי מפתח בפוטנציאל התמיינות:

ככל שתהליך ההתמיינות מתקדם, הפוטנציאל הולך וקטן - יותר גנים מושתקים, פחות אפשרויות נותרות.

3. מורפוגנזה (Morphogenesis)

תהליך יצירת צורת הגוף - לא רק שיהיו תאים מסוגים שונים, אלא שהם יתמקמו במקומות הנכונים ויצרו איברים מאורגנים.

למה צריך צירים? בדיוק כמו שצייר משתמש בקווי עזר, כך התאים צריכים “מערכת קואורדינטות” כדי לדעת:

• מה קדמי ומה אחורי
• מה עליון ומה תחתון
• ימין ושמאל

ללא מורפוגנזה תקינה: גם אם תהליך ההתמיינות מצליח, התאים עלולים להתפזר באופן אקראי - תא לב במקום הראש, תא מוח באזור הבטן.

מורפוגנים ויצירת צירי הגוף

מהם מורפוגנים?

מורפוגנים הם מולקולות סיגנל (בדרך כלל חלבונים) שמופרשות באזורים ספציפיים בעובר ויוצרות גרדיאנט ריכוזים - ריכוז גבוה באזור ההפרשה, וריכוז יורד ככל שמתרחקים.

עקרון הפעולה:

ריכוז גבוה ←――――――――――――――――→ ריכוז נמוך
   ↓                              ↓
ביטוי גן A                    ביטוי גן C
         ↓
      ביטוי גן B

• תאים שקולטים ריכוז גבוה של מורפוגן ← מבטאים קבוצת גנים מסוימת
• תאים שקולטים ריכוז בינוני ← מבטאים קבוצת גנים אחרת
• תאים שקולטים ריכוז נמוך או אפסי ← מבטאים קבוצת גנים שלישית

חשוב: לכל התאים יש רצפטורים לאותו מורפוגן, אבל רמת הסיגנל שנקלטת קובעת איזה גנים יתבטאו.

דוגמה: Bicoid ו-Caudal בזבוב הפירות

בזבוב הפירות (Drosophila), שני מורפוגנים מרכזיים קובעים את ציר ראש-זנב:

סנכרון בין המורפוגנים: חלבון Bicoid מעכב את יצירת חלבון Caudal - כך שבאזור שיש הרבה Bicoid, לא יהיה Caudal, ולהיפך. מנגנון זה מבטיח הפרדה ברורה בין הצירים.

מקור האפקט המטרנלי: mRNA של Bicoid קיים כבר בתא הביצית עוד לפני ההפריה, ממוקם בצד ספציפי - זו נקודת ההתחלה של כל תהליך קביעת הצירים.

גנים הומיאוטיים (Hox Genes) בבני אדם

בבני אדם, גנים הנקראים Hox genes (או גני סגמנטציה) אחראים על קביעת דפוסי הגוף לאורך ציר קדמי-אחורי.

תפקיד: קביעת “גורל” של אזורים שונים בגוף - איזה איברים יתפתחו באיזה אזור.

פגמים בגנים הומיאוטיים: כשיש מוטציה במורפוגנזה, התוצאות הן לרוב לא-לטאליות רק במקרים חלקיים - רוב הפגמים הקשים מובילים להפלה ספונטנית בשליש הראשון של ההריון.

תאי גזע (Stem Cells)

מהם תאי גזע?

תאי גזע הם תאים שעדיין לא סיימו את תהליך ההתמיינות - יש להם פוטנציאל להתחלק ולהתמיין לסוגי תאים שונים.

סוגי תאי גזע

תאי גזע עובריים:

• פוטנציאל התמיינות גבוה (Pluripotent עד Totipotent)
• נמצאים בשלבים מוקדמים של ההתפתחות

תאי גזע בבוגר:

• פוטנציאל מוגבל יותר
• דוגמה מרכזית: תאי גזע במח העצם - יכולים להתחלק לכל סוגי תאי הדם

מה קובע לאן תא גזע יתמיין?

• סיגנלים מהסביבה - מה הרקמה צריכה, מה חסר
• פקטורי גדילה שונים - פקטורים שונים מעודדים התמיינות לכיוונים שונים

חשיבות קלינית של תאי גזע

דם טבורי: מכיל תאי גזע עובריים “צעירים” עם פוטנציאל התמיינות גבוה יותר מתאי גזע בבוגר. כיום נשמר בהקפאה לשימוש עתידי פוטנציאלי.

אפופטוזיס בהתפתחות

גם מוות תאי מתוכנת הוא חלק קריטי מההתפתחות התקינה.

דוגמה קלאסית: האצבעות שלנו נוצרות כ”גוש” אחד, והרווחים ביניהן נוצרים על ידי מוות מתוכנת של התאים באזורים שבין האצבעות.

כשאפופטוזיס לא מתרחש כראוי באזורים הללו, עלולה להיווצר סינדקטיליה (איחוי אצבעות).

חלק ב’: ריצוף הגנום האנושי

רקע - שיטת Sanger לריצוף

שיטת Sanger מבוססת על עקרונות ה-PCR עם תוספת קריטית אחת:

הרכיבים:

• DNA תבנית
• פריימרים ספציפיים
• נוקלאוטידים חופשיים (dNTPs)
• ddNTPs (Dideoxy-nucleotides) - מסומנים פלואורסצנטית
• אנזים Taq polymerase (עמיד בחום)

עקרון הפעולה: ה-ddNTPs דומים לנוקלאוטידים רגילים, אבל לא מסוגלים להתארך בקצה 3’ - כשהם מצטרפים לשרשרת, הסינתזה נעצרת.

התוצאה: בהרבה ריאקציות מקבילות, נוצרים מקטעים בכל האורכים האפשריים - מהקצר ביותר ועד הארוך ביותר. כל מקטע מסומן בצבע לפי הנוקלאוטיד האחרון שלו.

מגבלה קריטית: השיטה מדויקת עד כ-1,000 בסיסים בלבד. מעבר לכך, האיכות יורדת משמעותית.

הבעיה: כיצד לרצף 3 מיליארד בסיסים?

הגנום האנושי מכיל כ-3 מיליארד זוגות בסיסים. עם מגבלת Sanger של ~1,000 bp, נדרשים מיליוני מקטעים - בלתי אפשרי בשיטה ישירה.

שיטה 1: הליכה על גבי הכרומוזום (Chromosome Walking)

העיקרון

1. יצירת ספריות DNA: שבירת הגנום למקטעים באמצעות אנזימי רסטריקציה או גלי קול (סוניקציה), והכנסתם לווקטורים (פלסמידים או פאג’ים) בתוך חיידקים.

2. זיהוי סמנים: שימוש בסמנים גנטיים - רצפי DNA קצרים וייחודיים שמופיעים פעם אחת בגנום.

3. הליכה משמן לסמן:
   • מרצפים מקטע שמכיל סמן ידוע
   • מזהים סמן נוסף במקטע
   • מחפשים מקטע אחר שמכיל את הסמן הזה
   • ממשיכים כך “צעד אחר צעד”
4. בניית קונטיגים (Contigs): חיבור מקטעים שיש ביניהם חפיפה ליצירת רצפים ארוכים יותר.

מה מאפשר את החיבור? חיתוך עם אנזימי רסטריקציה שונים יוצר מקטעים שיש ביניהם אזורים חופפים - כך ניתן לזהות את הסדר הנכון.

חיסרון מרכזי: שיטה איטית מאוד, סיזיפית, דורשת עבודה ידנית רבה.

שיטה 2: Shotgun Sequencing

העיקרון (פותח על ידי חברת Celera)

1. שבירה אקראית: שבירת הגנום למקטעים קצרצרים (1,000-2,000 bp) באמצעות גלי קול - ללא אנזימי רסטריקציה.

2. ריצוף מסיבי: ריצוף של כל המקטעים במקביל.

3. הרכבה חישובית: שימוש במחשבי ענק לזיהוי חפיפות ובניית הרצף המלא.

יתרונות:

• מהיר יותר משמעותית
• לא דורש זיהוי סמנים מראש
• ניתן לרצף מקטעים רבים במקביל

חיסרון: דורש כוח חישובי עצום

פרויקט הגנום האנושי - המירוץ

הפרויקט הציבורי (1990-2005)

• מימון: NIH וממשלות (18 מדינות, כולל ישראל)
• שיטה: Chromosome Walking
• מטרות:
  1. פענוח רצף 3 מיליארד בסיסים
  2. קביעת מיקום כל רצף
  3. זיהוי מספר הגנים
  4. יצירת מאגר מידע פתוח לציבור
• מקור ה-DNA: 100 מתנדבים מקבוצות אתניות שונות (לא אדם בודד!)

חברת Celera (הפרויקט הפרטי)

• שיטה: Shotgun Sequencing
• יתרון: מהירות גבוהה יותר, עלות נמוכה יותר
• בעיה אתית: חברה פרטית עם אינטרסים מסחריים - סכנה שהמידע הגנטי יהיה בבעלות פרטית

התוצאה

שתי הקבוצות הגיעו לסיום כמעט בו-זמנית. המידע נותר פתוח לציבור.

התקדמות הטכנולוגיה:

• פרויקט מקורי: ~15 שנים, מיליוני דולרים
• כיום (NGS): פחות מחודשיים, ~1,000 דולר לאדם

מה גילינו מריצוף הגנום?

הרכב הגנום האנושי

תובנה מפתיעה: רק 1.5% מה-DNA שלנו מקודד לחלבונים! השאר - חלקו בעל תפקיד בקרתי, חלקו שריד אבולוציוני, וחלקו עדיין לא מובן.

מאגר UCSC Genome Browser

לאחר ריצוף הגנום נוצר מאגר מידע מקיף המאפשר:

• צפייה בכל כרומוזום ואזוריו
• זיהוי גנים, אקסונים ואינטרונים
• מיקום SNPs ווריאנטים
• השוואה לגנומים של אורגניזמים אחרים
• מידע על כל נוקלאוטיד בגנום

חלק ג’: טרנספוזונים (Transposable Elements)

מהם טרנספוזונים?

טרנספוזונים הם מקטעי DNA שיכולים לעבור ממקום למקום בתוך הגנום. הם אחד ההסברים המרכזיים לקיום רצפים חזרתיים בגנום.

שני סוגי טרנספוזונים

Class II - DNA Transposons (Cut and Paste)

מנגנון:

1. אנזים טרנספוזאז מזהה את הטרנספוזון
2. האנזים חותך את הטרנספוזון ממקומו המקורי
3. הטרנספוזון משתלב במקום אחר בגנום

מקום מקורי: ──[TRANSPOSON]──  →  ─────────────
                    ↓
מקום חדש:    ─────────────  →  ──[TRANSPOSON]──

Class I - Retrotransposons (Copy and Paste)

מנגנון:

1. הטרנספוזון משועתק ל-RNA
2. אנזים Reverse Transcriptase יוצר cDNA מה-RNA
3. ה-cDNA החדש משתלב במקום אחר בגנום
4. העותק המקורי נשאר במקומו

מקום מקורי: ──[TRANSPOSON]──  →  ──[TRANSPOSON]──  (נשאר!)
                    ↓ שעתוק
                  [RNA]
                    ↓ Reverse Transcription
                  [cDNA]
                    ↓
מקום חדש:    ─────────────  →  ──[TRANSPOSON]──

הבדל קריטי: ב-Cut and Paste יש העברה. ב-Copy and Paste יש שכפול - נוצר עותק נוסף.

משמעות אבולוציונית

תרומות פוטנציאליות:

• יצירת עותקים של גנים חשובים - “גיבוי” גנטי
• שינוי בקרה - גן שעובר מקום עשוי להיות תחת בקרה שונה
• הגברת שונות גנטית - מנגנון לשינוי מהיר יחסית

סיכונים:

• השתלבות בתוך גן פעיל עלולה לשבש אותו
• עלול לגרום למוטציות מזיקות

קצב התנועה: טרנספוזונים לא נעים כל הזמן - התנועה יכולה להתרחש בתדירות נמוכה מאוד (פעם בדורות רבים).

שימוש במחקר

חוקרים משתמשים בטרנספוזונים ככלי מחקר:

• יצירת מוטציות מכוונות - הכנסת טרנספוזונים לגנים ספציפיים
• מעקב אחר ביטוי גנים - הוספת סמנים (כמו GFP) לטרנספוזון
• פוטנציאל לטיפול גנטי - הכנסת גנים תרפויטיים

חלק ד’: שיטות מחקר גנטי

Forward vs. Reverse Genetics

Forward Genetics

כיוון: מפנוטיפ ← לגנוטיפ

השאלה: יש לי תופעה/מחלה - איזה גן אחראי?

שיטות:

• השוואת רצפים בין קבוצות (חולים vs. בריאים)
• מחקרי GWAS (Genome-Wide Association Studies)

Reverse Genetics

כיוון: מגנוטיפ ← לפנוטיפ

השאלה: יש לי גן - מה הוא עושה?

שיטות:

• Knockout - השבתת גן ובדיקת ההשפעה
• מוטגנזה מכוונת - יצירת מוטציות בגנים ספציפיים
• שימוש בטרנספוזונים - הכנסה אקראית ומעקב אחר פנוטיפים
• ביטוי יתר - הגברת ביטוי של גן ובדיקת ההשפעה

מחקרי GWAS

מהו GWAS? Genome-Wide Association Study - מחקר שמשווה את כל הגנום בין קבוצות גדולות.

העיקרון:

1. איסוף קבוצה גדולה של אנשים עם מאפיין/מחלה מסוימים
2. איסוף קבוצת ביקורת (ללא המאפיין)
3. ריצוף/סריקת הגנום של כל המשתתפים
4. זיהוי אזורים גנטיים שונים באופן מובהק בין הקבוצות

למה צריך קבוצות גדולות? כי יש הרבה שונות “רגילה” בין אנשים - צריך מספיק נבדקים כדי להבחין בין שונות אקראית לבין שונות הקשורה למאפיין הנחקר.

פרויקט 1,000 Genomes

תקופה: 2008-2015

מטרות:

1. בניית מפה מפורטת של שונות גנטית באוכלוסייה
2. זיהוי מוטציות הגורמות למחלות
3. הבנת שינויים אבולוציוניים בגנום האנושי

ממצאים:

• זוהו כ-2,000 לוקוסים הקשורים ל-300+ מחלות
• בממוצע, לכל אדם 250-300 וריאנטים הגורמים לאובדן פעילות של אלל אחד
• קצב המוטציות בדורות גבוה ממה שחשבו

סיכום לבחינה

גנטיקה התפתחותית

• שלושה תהליכים מקבילים: חלוקה מוגברת, התמיינות, מורפוגנזה
• מורפוגנים: חלבונים שמופרשים ויוצרים גרדיאנט ריכוזים; רמות שונות מפעילות גנים שונים
• Bicoid - מורפוגן ראש; Caudal - מורפוגן זנב (בזבוב)
• Hox genes - גנים הומיאוטיים בבני אדם לקביעת צירי הגוף
• פוטנציאל התמיינות: Totipotent > Pluripotent > Multipotent > Tissue-specific
• תאי גזע בבוגר: מח עצם - יכולים להתחלק לכל תאי הדם

ריצוף הגנום

• Sanger: מדויק עד ~1,000 bp בלבד
• Chromosome Walking: איטי, מבוסס סמנים וחפיפות
• Shotgun Sequencing: מהיר, מבוסס חישוב
• פרויקט הגנום: 1990-2005, 100 מתנדבים, מידע פתוח לציבור
• הרכב הגנום: רק 1.5% מקודד, ~60% רצפים חזרתיים

טרנספוזונים

• Class I (Retrotransposons): Copy and Paste דרך RNA
• Class II (DNA Transposons): Cut and Paste ישיר
• משמעות: הסבר לרצפים חזרתיים, מנגנון אבולוציוני

שיטות מחקר

• Forward Genetics: פנוטיפ ← גנוטיפ (GWAS)
• Reverse Genetics: גנוטיפ ← פנוטיפ (Knockout, מוטגנזה)
• GWAS: השוואת גנום בין קבוצות גדולות

לקסיקון מונחים