מבוא: אנזימים כקטליזטורים ביולוגיים

הגדרות ומושגי יסוד

  • אנזים (Enzyme): חלבון עם פעילות קטליטית. יש גם RNA קטליטיים הנקראים ריבוזימים (Ribozymes)
  • אתר פעיל (Active Site): חלל תלת-ממדי בחלבון שבו מתרחשת הקטליזה
  • סובסטרט (Substrate, S): המגיב בריאקציה האנזימטית
  • תוצר (Product, P): התוצר של הריאקציה האנזימטית

עקרון הפעולה של אנזימים

אנזימים לא קובעים האם ריאקציה תתרחש או לא - הם רק מזרזים ריאקציות שהן תרמודינמית אפשריות ($\Delta G < 0$).

דוגמה: המרת פירובט לאצטיל-CoA על ידי פירובט דהידרוגנאז:

  • ללא האנזים - הריאקציה כל כך איטית שלא היינו יכולים לקיים מעגל קרבס
  • עם האנזים - הריאקציה מתרחשת במהירות המאפשרת חיים

אנרגיית אקטיבציה והורדתה

  • אנרגיית אקטיבציה: ההפרש באנרגיה החופשית בין המגיבים לפיק המחסום האנרגטי
  • אנזימים מורידים את אנרגיית האקטיבציה אך לא משנים את ה-$\Delta G$ של הריאקציה
  • ההאצה יכולה להגיע לפי 10,000-10,000,000

מאפייני האתר הפעיל

תכונות מבניות

  1. חלק קטן מהחלבון - רוב מסת החלבון משמשת לייצוב ומיקום מדויק של האתר הפעיל
  2. התכנסות שיירים רחוקים - שיירי צד הרחוקים ברצף מתקרבים במרחב התלת-ממדי
  3. ספציפיות גבוהה - התאמה מדויקת לסובסטרט

דוגמה: פרוטאז NS2B-NS3 של נגיף דנגי

הטריאדה הקטליטית:

  • $\ce{Ser 135}$ - השייר הקטליטי העיקרי (נוקלאופיל)
  • $\ce{His 51}$ - בסיס כללי
  • $\ce{Glu 75}$ - מייצב את ההיסטידין

הפרוטאז מזהה רצף ספציפי: $\ce{E-N-L-Y-F-Q\downarrow G}$ (חיתוך בין $\ce{Q}$ ל-$\ce{G}$)

סוגי התאמה לסובסטרט

  1. התאמה גיאומטרית - הכיס באנזים מתאים לצורת הסובסטרט
  2. התאמה אלקטרוסטטית - משיכה בין מטענים מנוגדים (למשל $\ce{Arg+}$ ל-$\ce{Glu-}$)
  3. התאמה הידרופובית - אזורים הידרופוביים בסובסטרט נכנסים לכיסים הידרופוביים

Induced Fit - התאמה מושרית

מנגנון שהדגים הקסוקינאז:

  1. $\ce{glucose}$ נקשר לאתר הפעיל
  2. האנזים משנה קונפורמציה
  3. השינוי מקרב את ה-$\ce{ATP}$ ל-$\ce{glucose}$
  4. מתאפשרת העברת פוספט מ-$\ce{ATP}$ לפחמן 6 של ה-$\ce{glucose}$

חשוב: האתר הפעיל לא מתאים 100% לסובסטרט - אחרת האנזים היה “תקוע” עם הסובסטרט

קו-פקטורים וקו-אנזימים

קו-פקטורים (Cofactors)

מולקולות קטנות או יונים הנדרשים לפעילות:

  • $\ce{Mg^2+}$ - נדרש לקישור $\ce{ATP}$ (הקסוקינאז, קרבוניק אנהידראז)
  • $\ce{Zn^2+}$ - קרבוקסיפפטידאז, קרבוניק אנהידראז
  • $\ce{Fe^2+/Fe^3+}$ - ציטוכרומים, פרוקסידאזות

מונחים:

  • אפו-אנזים (Apoenzyme) - האנזים ללא הקו-פקטור
  • הולו-אנזים (Holoenzyme) - האנזים + קו-פקטור (הצורה הפעילה)

קו-אנזימים (Coenzymes)

נגזרות של ויטמינים:

  • $\ce{NAD+/NADH}$ - נגזרת של ניאצין (B3), נשא אלקטרונים
  • $\ce{FAD/FADH2}$ - נגזרת של ריבופלאבין (B2)
  • תיאמין פירופוספט ($\ce{TPP}$) - נגזרת של תיאמין (B1), חיונית לפירובט דהידרוגנאז
  • קו-אנזים A - נגזרת של חומצה פנטותנית

דוגמה קלינית: צפדינה (Scurvy) - מחסור בויטמין C גורם לפגיעה בסינתזה של קולגן

שישה סוגי אנזימים (לפי EC Classification)

1. אוקסידורדוקטאזות (EC 1)

ריאקציות חמצון-חיזור:

\[\ce{ethanol + NAD+ ->[alcohol dehydrogenase] acetaldehyde + NADH + H+}\]

זיהוי: שם האנזים מכיל “דהידרוגנאז”

2. טרנספראזות (EC 2)

העברת קבוצות פונקציונליות:

\[\ce{glucose + ATP ->[hexokinase] glucose-6-phosphate + ADP}\]

העברת פוספט γ מ-$\ce{ATP}$ לפחמן 6

3. הידרולאזות (EC 3)

שבירת קשרים בעזרת מים:

  • פרוטאזות - הידרוליזה של קשרים פפטידיים
  • ליפאזות - הידרוליזה של אסטרים
  • גליקוזידאזות - הידרוליזה של קשרים גליקוזידיים

דוגמה: TEV פרוטאז (ציסטאין פרוטאז)

4. ליאזות (EC 4)

יצירת קשרים כפולים על ידי הוצאת קבוצות:

\[\ce{2-phosphoglycerate ->[enolase] phosphoenolpyruvate + H2O}\]

5. איזומראזות (EC 5)

שינוי מבני בתוך המולקולה:

\[\ce{glucose-6-phosphate <=>[phosphohexose isomerase] fructose-6-phosphate}\]

המרה מטבעת 6 איברים לטבעת 5 איברים (דורש $\ce{Mg^2+}$)

6. ליגאזות (EC 6)

חיבור שתי מולקולות תוך צריכת $\ce{ATP}$:

  • DNA ליגאז - מחבר מקטעי אוקזאקי בשכפול DNA
  • חיבור קשר פוספודיאסטר בין 3’-OH ל-5’-פוספט

מצב המעבר (Transition State)

המושג והחשיבות

מצב המעבר ($\ce{S^‡}$) הוא הקונפורמציה בעלת האנרגיה הגבוהה ביותר במסלול הריאקציה.

אנלוגיית מקל המתכת (מהפרופסור):

  • מקל ישר = סובסטרט
  • מקל מכופף = מצב מעבר
  • שני חצאים = תוצרים
  • ככל שהמקל נשאר יותר זמן מכופף, הסיכוי לשבירה גדל

מנגנון ייצוב מצב המעבר

  1. האתר הפעיל לא מתאים בדיוק לסובסטרט
  2. האתר הפעיל מתאים יותר למצב המעבר
  3. הייצוב מוריד את אנרגיית האקטיבציה
  4. מאפשר התקדמות לתוצרים

נקודה חשובה: אם האנזים היה מתאים בדיוק לסובסטרט, הוא היה יוצר מינימום אנרגטי עמוק והריאקציה לא הייתה מתקדמת!

שלבי הריאקציה האנזימטית

\[\ce{E + S <=>[k_1][k_{-1}] ES ->[k_2] EP ->[k_3] E + P}\]

קבועי המהירות:

  • $k_1$ = קבוע קישור סובסטרט
  • $k_{-1}$ = קבוע דיסוציאציה של $\ce{ES}$
  • $k_2$ = קבוע קטליזה ($k_\text{cat}$)
  • $k_{-2} \approx 0$ (מזניחים בדרך כלל)

קינטיקה אנזימטית - תיאורית מיכאליס-מנטן

הנחות היסוד (מ-1913)

  1. מצב עמיד (Steady State):
    • $[\ce{ES}]$ קבוע לאורך המדידה
    • $d[\ce{ES}]/dt = 0$
  2. מזניחים ריאקציה הפוכה: $k_{-2} \approx 0$
  3. מדידה בתחילת הריאקציה: $[\ce{P}] \approx 0$

פיתוח המשוואה

הגדרות:

  • \[\left[\ce{E}\right]_{\text{total}} = \left[\ce{E}\right]_{\text{free}} + \left[ \ce{ES} \right]\]
  • במצב עמיד: קצב יצירת $\ce{ES}$ = קצב פירוק $\ce{ES}$

קבוע מיכאליס ($K_m$):

\[K_m = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}\]

משמעות $K_m$:

  • ריכוז הסובסטרט כאשר $V = V_\max/2$
  • יחידות: מולר (M)
  • מדד לאפיניות ($K_m$ נמוך = אפיניות גבוהה)

משוואת מיכאליס-מנטן

\[V_0 = \frac{V_\max \times [\ce{S}]}{K_m + [\ce{S}]}\]

כאשר:

  • $V_0$ = מהירות התחלתית
  • $V_\max = k_2 \times [\ce{E}]_\text{total}$
  • $[\ce{S}]$ = ריכוז סובסטרט

גרף מיכאליס-מנטן

  • עקומה היפרבולית (רוויה)
  • ב-$[\ce{S}] \ll K_m$: התנהגות ליניארית (מסדר ראשון)
  • ב-$[\ce{S}] \gg K_m$: התנהגות של רוויה (מסדר אפס)
  • ב-$[\ce{S}] = K_m$: $V = V_\max/2$

מדידות מעשיות

מהירות התחלתית ($V_0$)

למה מודדים רק בהתחלה?

  • בריאקציות הפיכות, הצטברות תוצר גורמת לריאקציה הפוכה
  • מדידה בשניות/מילישניות הראשונות
  • האזור הליניארי של הגרף

ניסוי טיפוסי

  1. סדרת מבחנות עם ריכוזי סובסטרט עולים
  2. כמות אנזים זהה בכל מבחנה
  3. מדידת $V_0$ בכל מבחנה
  4. בניית גרף $V_0$ מול $[\ce{S}]$

שיטות מעקב

  • ספקטרופוטומטריה - שינוי בבליעה ($\ce{NADH}$ בולע ב-340nm)
  • פלואורסנציה - תוצר פלואורסנטי
  • pH - שחרור/צריכת פרוטונים
  • טמפרטורה - ריאקציות אקסותרמיות

דוגמאות ספציפיות מההרצאה

הקסוקינאז

  • אנזים ראשון בגליקוליזה
  • ריאקציה בלתי הפיכה (שלב קובע מהירות)
  • מונע יציאת $\ce{glucose}$ מהתא (לאחר זירחון)
  • 4 איזוזימים בגוף האדם

משל פועל הפס הייצור

להמחשת $V_\max$:

  • 3 קופסאות/יום - קל מאוד
  • 100 קופסאות/יום - עדיין אפשרי
  • 2000 קופסאות/יום - רק 1500 (המקסימום)
  • 3000 קופסאות/יום - עדיין רק 1500

נקודות קריטיות להבנה

  1. תרמודינמיקה מול קינטיקה: אנזים משפיע על מהירות, לא על כיוון
  2. $\Delta G$ חייב להיות שלילי: אנזים לא הופך ריאקציה לא ספונטנית לספונטנית
  3. קשרים לא קובלנטיים: מלבד תוצרי ביניים קובלנטיים רגעיים (כמו בסרין פרוטאזות)
  4. יעילות מוגבלת בדיפוזיה: המהירות המקסימלית מוגבלת במהירות המפגש בין אנזים לסובסטרט (~$10^8$-$10^9$ M$^{-1}$s$^{-1}$)
דור פסקל
חזור לשיעור הקודם