שיעור 6 שבירת סימטריה

פתיחה: מהי שבירת סימטריה?

בשיעור הקודם הוצג המודל שבו ההבחנה בין תאים חיצוניים לפנימיים נוצרת דרך שילוב של Compaction, Polarization, מסלול Hippo, ורמות שונות של Cdx2. התאים החיצוניים מבטאים יותר Cdx2 ומתפתחים לכיוון Trophectoderm, ואילו בפנימיים Cdx2 יורד, והם נשארים במסלול של ICM.

השאלה המרכזית של השיעור הנוכחי היא איך בכלל מגיעים למצב כזה:

איך עובר שנראה בתחילה סימטרי, מגיע למצב שבו בשלב שמונת התאים, יש תאים עם רמות שונות של Cdx2?

כלומר, מחפשים את נקודות ההתחלה של שבירת הסימטריה. כדי לעשות זאת חוזרים אחורה: משלב שמונת התאים, אל שלב ארבעת התאים, אל שלב שני התאים, ולבסוף אל הזיגוטה.

התפתחות דטרמיניסטית לעומת התפתחות רגולטיבית

אפשר להבחין בין שני דפוסי התפתחות כלליים בבעלי חיים: התפתחות דטרמיניסטית והתפתחות רגולטיבית.

בביצית אנושית, לפחות לפי המראה החיצוני, אין הבדלים מרחביים בולטים. לעומת זאת, בביצים של צפרדע ניתן לראות אזורים שונים, למשל אזור פיגמנטי כהה ואזור בהיר יותר. מכאן שהיא אינה הומוגנית: חומרים שונים ממוקמים באזורים שונים עוד לפני החלוקות הראשונות.

התפתחות דטרמיניסטית

במודל דטרמיניסטי, הביצית עצמה כבר מכילה חלוקה מרחבית של חומרים, מורפוגנים או דטרמיננטים, ולכן גורל התאים הראשונים נקבע מוקדם מאוד.

C. elegans - תולעת

למשל ב־C. elegans, תולעת שמורכבת מכאלף תאים, הביצית מכילה חומרים שמסודרים באופן לא שווה. אחרי ההפריה מתרחשת חלוקה א-סימטרית, וכבר בשלב שני התאים מתקבלים שני תאים בעלי זהות שונה. אם מוציאים אחד מהם, ההתפתחות לא יכולה להמשיך באופן תקין, כי אחד המרכיבים החיוניים להתפתחות כבר חסר.

זה מודל דטרמיניסטי: ההתפתחות מוכתבת מוקדם מאוד על ידי מה שהיה מסודר בביצית.

התפתחות רגולטיבית

ביונקים, הדפוס שונה. ההתפתחות היא רגולטיבית: עד לשלב הבלסטוציסט, המערכת עדיין גמישה ויכולה להתארגן מחדש. אם מוציאים תא, מפרידים תאים, או מבצעים מניפולציות מסוימות, לעיתים העובר עדיין מסוגל להתפתח, משום שהגורל טרם נקבע באופן בלתי הפיך.

המשמעות היא שלא הביצית לבדה מכתיבה מראש את כל ההתפתחות; יש מערכת שמסוגלת לווסת, לפצות ולהתארגן מחדש.

יש גם בעלי חיים שנמצאים במצב ביניים, למשל קיפודי ים או צפרדעים, שבהם הביצית אינה הומוגנית והחלוקות הראשונות כבר מייצרות הבדלים מסוימים, אך לא תמיד מדובר בדטרמיניזם מוחלט.

למה יש יתרון לשני הדפוסים?

היתרון תלוי בצורת הרבייה של האורגניזם. בבעלי חיים שמטילים מספר גדול מאוד של ביצים, פגיעה בחלק מהעוברים לא בהכרח תהווה בעיה אבולוציונית משמעותית, כי עדיין יישארו עוברים שימשיכו להתפתח. ביונקים, לעומת זאת, לרוב יש מספר קטן של עוברים, ולכן יש יתרון למערכת רגולטיבית שמסוגלת להתאושש מפגיעה או שינוי מוקדם.

התפתחות סטוכסטית לעומת התפתחות פרובביליסטית

בתוך ההתפתחות הרגולטיבית עצמה צריך להבחין בין שני מושגים:

כשאומרים שהתהליך פרובביליסטי, הכוונה שיש הטיה התחלתית: תא מסוים מקבל סיכוי גבוה יותר ללכת לכיוון אחד, ותא אחר מקבל סיכוי גבוה יותר ללכת לכיוון אחר.

ההבחנה הזאת מלווה את כל הדיון בשבירת סימטריה. נרצה לדעת אם הבדלים בין תאים הם אקראיים לגמרי (התפתחות סטוכסטית) או שיש מנגנון שמטה את ההתפתחות בכיוון מסוים (פרובביליסטית).

צירי העובר ומישורי החלוקה

כדי להבין מתי מתחילים ההבדלים בין התאים, צריך להסתכל על מישורי החלוקה (Division planes). מישור החלוקה קובע איך תא מתחלק, ואילו חלקים ממנו יקבל כל תא בת.

זיגוטה ו־one cell embryo

בזיגוטה ניתן לזהות שני גרעינים לפני האיחוי ואת ה־Polar body. הביצית עצמה נראית כדורית יחסית, ולכן קשה לראות בה ציר חיצוני ברור, אבל ה־Polar body מגדיר ציר חשוב:

בחלוקה הראשונה של הזיגוטה, מישור החלוקה נוטה להסתדר בערך במקביל לציר ה־animal-vegetal. לכן כבר בשלב זה יש לעובר כיוון חלוקה מועדף.

זה תהליך פרובביליסטי: החלוקה מושפעת מציר קיים בביצית, ולא אקראית לחלוטין.

הציר Embryonic-Abembryonic בבלסטוציסט

בבלסטוציסט מופיע ציר נוסף: Embryonic-Abembryonic axis:

• בצד ה־Embryonic נמצא ה־ICM, ממנו יתפתח העובר
• בצד ה־Abembryonic אין ICM

גם ב־Trophectoderm עצמו מבחינים בין שני אזורים:

השאלה אם יש קשר בין ציר ה־animal-vegetal, שמוגדר כבר בזיגוטה, לבין ציר ה־embryonic-abembryonic שמופיע בבלסטוציסט.

Cell lineage analysis: ניתוח שושלת תאים

כדי לבדוק את הקשר בין הצירים מבצעים Cell lineage analysis: לוקחים עובר בשלב שני תאים, ומסמנים כל תא בצבע פלואורסצנטי אחר. לאחר מכן עוקבים אחרי העובר עד לשלב הבלסטוציסט ובודקים לאן הגיעו הצאצאים של כל תא.

הניסוי מעלה שתי תובנות:

1. אין ערבוב משמעותי בין התאים - אם תא אחד סומן באדום והשני בכחול, מתקבל לרוב בלסטוציסט שבו חצי אדום וחצי כחול; חצי אחד מקורו בתא אחד וחצי אחר מקורו בתא השני. הצאצאים של כל בלסטומר נשארים יחסית יחד.

2. הציר embryonic-abembryonic מאונך בקירוב לציר animal-vegetal - בבלסטוציסט, הציר ה־embryonic-abembryonic נוטה להסתדר כמעט בניצב לציר ה־animal-vegetal כדפוס ביולוגי כללי (לא זווית מדויקת של 90 מעלות).

המסקנה: כבר בשלבים המוקדמים יש לעובר ארגון מרחבי; מישור החלוקה הראשון קשור לכיוון שבו יתארגן בהמשך הציר embryonic-abembryonic (במילים אחרות: הצירים לא מופיעים לגמרי באקראי).

האם שני הבלסטומרים הראשונים זהים?

לאחר החלוקה הראשונה מתקבלים שני בלסטומרים. השאלה המרכזית: האם הם זהים מבחינה התפתחותית: האם לכל אחד מהם יש אותו פוטנציאל לתרום לעובר, באותה הסתברות ובאותו אופן?

כדי לבדוק זאת משתמשים במודל של תאומים מונוזיגוטיים.

תאומים מונוזיגוטיים לעומת דיזיגוטיים

בעכברים אין תאומים מונוזיגוטיים באופן טבעי כמו בבני אדם. עכברים בנויים לשֶׁגֶר של כמה עוברים, ולכן אינם מודל טבעי לחקר תאומים. אבל אפשר לבצע מניפולציה ניסויית כדי לשאול שאלה ממוקדת: מה הפוטנציאל של כל אחד משני הבלסטומרים הראשונים?

יצירת תאומים מונוזיגוטיים בעכבר

הניסוי מתחיל בעובר בשלב שני תאים:

1. יוצרים חור קטן ב־Zona Pellucida
2. מפעילים לחץ בעזרת פיפטה
3. בלסטומר אחד יוצא החוצה
4. מוציאים גם את הבלסטומר השני
5. מקבלים שני בלסטומרים נפרדים, מחוץ ל־Zona Pellucida

לבלסטומר אחד קוראים twin, ולשני co-twin (השמות רק לצורך מעקב והתייחסות).

גם מחוץ ל־Zona Pellucida, שני הבלסטומרים יכולים להמשיך להתחלק ולהגיע לבלסטוציסט. לעיתים המבנים המרחביים נראים פחות “מסודרים” מהרגיל, למשל open-chain או tetrahedral conformation, אבל בסופו של דבר יכולים להיווצר בלסטוציסטים.

התפקיד הפיזיולוגי המרכזי של ה־Zona Pellucida הוא ההפריה - לאפשר לתא הזרע לזהות את הביצית. אחרי ההפריה העובר יכול להמשיך להתפתח גם מחוץ ל־Zona Pellucida בתנאי תרבית.

בניסוי הביקורת, עצם הפעולה הכירורגית לא פוגעת ביכולת להגיע לבלסטוציסט: עוברים שעברו הפרדה מגיעים לבלסטוציסט בשיעור דומה לביקורת. עם זאת, הבלסטוציסטים שנוצרו מכל חצי עובר מכילים פחות תאים מבלסטוציסט רגיל (בערך חצי).

נבהיר שבלסטוציסט מוגדר לפי המבנה שלו: Trophectoderm, Blastocoel ו־ICM - לא רק לפי מספר התאים.

מבחן השרשה: למה קשה להסיק ממנו?

השלב הבא הוא לשאול אם הבלסטוציסטים מסוגלים לעבור השרשה, להתפתח ולהיוולד.

קודם צריך לבדוק שהפעולה עצמה לא יוצרת בעיה. משווים לביקורת: מפרידים את שני הבלסטומרים ואז מחברים אותם חזרה, נותנים להם להתפתח לבלסטוציסט, ומשתילים אותם בנקבות פונדקאיות. בניסוי התקבלו 37 עוברים מתוך 76 שהושתלו, כלומר מראש ההשתלה עצמה היא תהליך בעייתי ולא כל העוברים שורדים.

כשמשווים לעוברים שלא עברו את הפעולה, שיעור ההצלחה דומה יחסית. לכן הפעולה הכירורגית עצמה היא לא ההסבר העיקרי לכישלון.

אבל כשמשתילים זוגות של “תאומים” מונוזיגוטיים בעכבר, קשה מאוד להסיק מסקנה חזקה. בעכבר צריך בדרך כלל שגר של כמה עוברים כדי שההיריון יצליח. אם משתילים רק זוג אחד, עצם תנאי ההשתלה כבר בעייתיים מאוד.

במבחן ההשרשה נולדו מקרים שבהם רק אחד משני התאומים שרד. זה רומז שאולי שני הבלסטומרים שונים בפוטנציאל שלהם.

אבל אותה בעיה הופיעה גם בזוגות דיזיגוטיים, כלומר בשני עוברים נפרדים שהושתלו יחד. לכן מבחן ההשרשה לבדו לא מספיק כדי לקבוע שהבלסטומרים שונים.

Outgrowth assay: בדיקת הפוטנציאל של הבלסטומרים בתרבית

כדי לעקוף חלק מהבעיות של השרשה בעכברים, משתמשים ב־Outgrowth assay. בניסוי כזה מניחים בלסטוציסט על צלחת תרבית, ותאי ה־Trophectoderm נפרסים עליה. ה־ICM נשאר מעליהם כגוש תאים.

כשעושים זאת לזוגות שמקורם בשני הבלסטומרים הראשונים, בודקים אם כל אחד מסוגל ליצור outgrowth תקין.

התוצאות מראות הבדל בין תאומים דיזיגוטיים למונוזיגוטיים:

• בזוגות דיזיגוטיים, ברוב גדול של המקרים שני העוברים יוצרים outgrowth
• בזוגות מונוזיגוטיים (שנוצרו מהפרדת שני הבלסטומרים), יש שיעור משמעותי של מקרים בהם רק תאום אחד יוצר outgrowth תקין

הניסוי תומך במסקנה ברורה יותר: הפוטנציאל ההתפתחותי של הבלסטומרים שונה.

כלומר, ההתפתחות עדיין רגולטיבית ויש יכולת תיקון, אבל שני הבלסטומרים הראשונים אינם שקולים.

Oct4-GFP ומספר תאי אפיבלסט

כדי להבין מה פירוש “פוטנציאל שונה”, מסתכלים על עכברים שבהם GFP נמצא תחת הבקרה של Oct4. בשלב הבלסטוציסט המאוחר, Oct4 משמש כאן כמרקר לתאי Epiblast.

בוחנים רק מקרים שבהם נוצרו על הצלחת שני מוקדי outgrowth. לאחר מכן בודקים אם בכל מוקד יש תאי Epiblast מסומנים.

אפשר לקבל שלושה מצבים:

בזוגות מונוזיגוטיים מתקבלת התפלגות שונה מזו של זוגות דיזיגוטיים: יש יותר מקרים שבהם רק אחד מהשניים יוצר Epiblast, או ששניהם לא יוצרים Epiblast ברור. בזוגות דיזיגוטיים, הרוב יוצרים Epiblast בשני הצדדים.

מכאן שההבדל בין שני הבלסטומרים מתבטא בעיקר ביכולת לייצר ICM/Epiblast.

בצביעות נוספות בוחנים מרקרים שונים:

ההבדל המרכזי בין twin ל־co-twin הוא בעיקר ב־ICM: כמה תאים בו מבטאים Nanog.

יותר תאי ICM חיוביים ל־Nanog מצביעים על יכולת טובה יותר ליצור Epiblast.

השוואה בין עובר שלם לחצי עובר

בניסוי נוסף משווים בין:

• Whole embryo - עובר שלם שהמשיך להתפתח משלב שני התאים
• Half embryo - בלסטומר אחד מתוך שניים, שהתפתח לבד

בבלסטוציסטים שנוצרו מחצי עובר יש שונות גדולה במספר תאי האפיבלסט: יש כאלה עם אפס תאי אפיבלסט, אחד, שניים, שלושה וכן הלאה. בעובר שלם, לעומת זאת, מספר תאי האפיבלסט גבוה יותר.

לאחר מכן משתילים בלסטוציסטים לפי מספר תאי האפיבלסט שלהם ובודקים אם הם נולדים. מספר נמוך מאוד של תאי אפיבלסט קשור לסיכוי נמוך להתפתחות תקינה. סביב ארבעה תאי אפיבלסט ומעלה כבר יש פוטנציאל טוב יותר להתפתחות, השרשה ולידה.

המבחן כאן הוא פונקציונלי: אם נולד בסוף עובר או לא. הניסוי לא עונה על השאלה אם לעוברים שנולדו יהיו בעיות מאוחרות יותר.

תאומים מונוזיגוטיים באדם ו־ART

לפני שמדברים על תאומים מונוזיגוטיים באדם צריך להכיר שני קרומים עובריים:

המקור של הקרומים מאפשר להסיק, בזהירות, באיזה שלב ייתכן שהתרחש הפיצול.

איך נוצרים תאומים מונוזיגוטים באדם

בבני אדם אין דרך ניסויית ישירה לבדוק את מנגנון ההיווצרות של תאומים, ולכן מדובר במודלים ובהשערות שמבוססים על מבנים שנראים באולטרסאונד והידע ההתפתחותי.

אפשר לחשוב על כמה אפשרויות:

1. פיצול בתוך ה־ICM - מתקבלים שני מוקדים בתוך אותו בלסטוציסט. אם הם קרובים מאוד, ייתכן שגם ה־Chorion וגם ה־Amnion משותפים.

2. שני מוקדי ICM נפרדים יותר - לכל עובר יכול להיווצר Amnion משלו, אבל ה־Chorion משותף, כי מקורו ב־Trophectoderm של אותו בלסטוציסט.

3. פיצול בשלב המורולה - שתי קבוצות תאים נפרדות יכולות ליצור שני בלסטוציסטים. במקרה כזה לכל עובר יהיה Chorion משלו ו־Amnion משלו. באולטרסאונד זה יכול להיראות כמו תאומים דיזיגוטיים, ולכן אין ודאות בלי בדיקת DNA.

הדרך הוודאית לדעת שתאומים הם מונוזיגוטיים היא בדיקת DNA (דמיון חיצוני הוא לא הוכחה).

מנגנון אפשרי: Blastocoel ו־Adherens junctions

אם ה־Adherens junctions של ה־ICM לא מספיק חזקים, ייתכן שבזמן יצירת ה־Blastocoel נוצרים שני חללים או שני מוקדים שמפרידים את ה־ICM לשני אזורים. בהמשך, כשהחללים גדלים או מתאחים, המבנה הפיזיקלי יכול להשאיר שני מוקדי ICM.

מודל נוסף קשור ליציאה מה־Zona Pellucida. אם הפתח נוצר באזור חריג, ייתכן שהלחץ של ה־Blastocoel גורם לכך שה־ICM יוצא ראשון, והיציאה עצמה יוצרת פיצול פיזיקלי ב־ICM.

אלה מודלים אפשריים, לא הוכחה אמפירית ישירה בבני אדם.

ART cases

במסגרת Assisted Reproduction Technologies (ART), למשל IVF, נצפו מקרים שיכולים להסביר יצירת תאומים מונוזיגוטיים:

• פגיעה או חור ב־Zona Pellucida בשלב שני התאים, כך שבלסטומר אחד יוצא החוצה וכל בלסטומר מתפתח לבלסטוציסט קטן.

• Assisted hatching בלייזר, שבו פתח לא מדויק ב־Zona Pellucida יכול לגרום ליציאה לא רגילה ולפיצול פיזיקלי.

• הקפאה והפשרה של עוברים (Vitrification) שמובילה לקריסה פיזיקלית של הבלסטוציסט, ולעיתים לאחר ההפשרה מתקבלים שני בלסטוציסטים.

גם אם פיצול כזה מתרחש, עדיין נשארת שאלה פתוחה: למה שני חלקים שנמצאים באותה Zona Pellucida לא מתאחדים חזרה? זו נקודה שלא נפתרה בשיעור, להבנתי.

ארמדילו: תאומים מונוזיגוטיים כתהליך לא אקראי

ארמדילו משמש דוגמה לכך שתאומים מונוזיגוטיים אינם חייבים להיות אירוע אקראי לחלוטין. בארמדילו יכולים להיווצר ארבעה עוברים זהים מאותה ביצית מופרית.

הדוגמה מדגישה עיקרון: כשתהליך מתרחש באופן עקבי במין מסוים, סביר שיש מאחוריו מנגנון מכוון או פרובביליסטי.

לכן תאומים מונוזיגוטיים יכולים להיווצר כתוצאה מתוכנית התפתחותית עם הטיה מסוימת, ולא רק באופן מקרי.

שלב ארבעת התאים: סוגי עוברים ומישורי חלוקה

אחרי שראינו ששני הבלסטומרים הראשונים אינם זהים, עוברים לשאלה הבאה: האם ארבעת הבלסטומרים בשלב ארבעת התאים זהים?

סוגי עובר - $\text{4-cell stage}$

בשלב ארבעת התאים מבחינים בין כמה אפשרויות, לפי מישורי החלוקה של שני הבלסטומרים משלב שני התאים.

סוג חלוקה	הסבר	שם העובר
Meridional division (M)	חלוקה במקביל לציר animal-vegetal	אם שני הבלסטומרים מתחלקים כך: MM embryo
Equatorial division (E)	חלוקה בכיוון אחר, סביב קו “משווה” ביחס לציר	אם שני הבלסטומרים מתחלקים כך: EE embryo
M ואז E או E ואז M	בלסטומר אחד מתחלק M והשני E	ME/EM embryo, לרוב מבנה tetrahedral

במדגם שתואר, מתוך 460 עוברים:

• כ־81% היו ME/EM, כלומר tetrahedral
• כ־11% היו MM
• כ־8% היו EE

בעוברים שהוצאו מנקבות, רוב העוברים מופיעים במבנה ME/EM וטטרהדרלי; MM ו־EE מופיעים בשכיחות נמוכה יותר.

לכן גם כאן מדובר בתהליך פרובביליסטי ולא סטוכסטי. ההתפלגות מוטה לטובת מבנה ME/EM, ולכן מדובר בדפוס פרובביליסטי.

פוטנציאל ההתפתחות של הצורות השונות

כשמשתילים את העוברים:

• ME/EM: כ־91% נולדו
• MM: כ־84% נולדו
• EE: כ־35% בלבד נולדו

כשמשתילים עוברים מהסוגים השונים, הפוטנציאל שונה; עוברים מסוג EE מציגים פוטנציאל נמוך יותר לעומת צורות אחרות. מכאן שמישורי החלוקה משפיעים גם על הסידור המרחבי של התאים וגם על הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם.

מי שתורם לצד העוברי

במבנה טטרהדרלי, אפשר לתת שמות לתאים לפי מיקומם ומקורם:

• שני התאים שמקורם בחלוקה מסוג M יכולים להיקרא AV או M cells
• התא שמקורו בחלוקה equatorial ונמצא קרוב ל־Polar body נקרא A
• התא שמקורו בחלוקה equatorial ונמצא רחוק מה־Polar body נקרא V

במעקב שושלת תאים רואים שתאים שונים תורמים לאזורים שונים בבלסטוציסט:

בשלב הזה הגורל עדיין גמיש, אבל התאים כבר שונים בפוטנציאל.

ניסוי כימרות מבלסטומרים בשלב ארבעת התאים

בניסוי נוסף מפרקים עוברים בשלב ארבעת התאים, מזהים את סוגי הבלסטומרים, ובונים כימרות:

• שלושה תאים מסוג AV/M
• שלושה תאים מסוג A
• שלושה תאים מסוג V

הסיבה שזה נקרא כימרה היא שכל עובר בשלב ארבעת התאים מכיל מספר מוגבל של תאים מכל סוג, ולכן כדי להרכיב שלושה תאים מאותו סוג צריך לקחת תאים מכמה עוברים.

אחרי שמרכיבים את הכימרות נותנים להן להתפתח לבלסטוציסטים ומשתילים אותן בנקבות.

התוצאות:

התוצאות מצביעות על הבדל בפוטנציאל ההתפתחותי בין סוגי התאים: כימרות שכללו תאי AV/M הצליחו יותר, כימרות מתאי A הצליחו פחות, ומתאי V לא התקבלו לידות בניסוי שתואר.

מכאן שבשלב ארבעת התאים כבר קיימת הטיה בין הבלסטומרים. תאים שונים יכולים לתרום לעובר בסיכוי שונה, גם אם הגורל שלהם עדיין גמיש ותלוי בהקשר.

בשלב הזה נכון לדבר על הטיה פרובביליסטית: יש הבדל בפוטנציאל, אבל אין עדיין קביעה קשיחה וסופית של גורל התא.

אצטילציה, מתילציה וקוד אפיגנטי

כדי להבין מה יכול ליצור הבדלים מוקדמים בין בלסטומרים, עוברים לאפיגנטיקה.

שתי רמות מרכזיות של רגולציה אפיגנטית:

1. DNA methylation
2. מודיפיקציות על היסטונים, למשל אצטילציה ומתילציה

ה־DNA מלופף סביב נוקלאוזומים. כשהכרומטין פתוח יותר, למשל במבנה של “beads on a string”, קל יותר לבצע שעתוק. כשהכרומטין דחוס יותר, השעתוק קשה יותר.

לכל היסטון יש Histone tail, אזור בקצה ה־N-טרמינלי. הזנבות עשירים בליזינים וארגינינים, שהם חומצות אמינו טעונות חיובית. מכיוון שה־DNA טעון שלילית, הזנבות עוזרים להחזיק אותו סביב ההיסטונים.

אצטילציה

אצטילציה על ליזינים בהיסטונים מפחיתה את האינטראקציה החזקה בין הזנבות החיוביים לבין ה־DNA השלילי. לכן היא קשורה לפתיחת הכרומטין ולאפשרות שעתוק.

מתילציה

מתילציה יכולה להתרחש על ליזין או על ארגינין בזנבות ההיסטונים.

ההשפעה שלה נקבעת לפי ההקשר המדויק: סוג ההיסטון, החומצה האמינית שעברה מתילציה, המיקום שלה ברצף, וחלבוני ה־reader שיודעים לזהות את הסימון בתא.

כאן נכנסים שלושה סוגי שחקנים:

לדוגמה, מתילציה על H3K4 יכולה להיקרא על ידי readers שמובילים להפעלת שעתוק, ואילו מתילציה על H3K9 יכולה להיקרא בהקשרים אחרים כרפרסיה.

זו הסיבה שמדברים על קוד אפיגנטי: התא לא “רואה” רק שיש מתילציה, אלא קורא את המיקום המדויק שלה ומתרגם אותה למשמעות ביולוגית.

H3R26me ו־Carm1

המודיפיקציה המרכזית שהוצגה היא מתילציה של Histone H3 arginine 26, כלומר H3R26me.

כשארגינין 26 בהיסטון H3 עובר מתילציה, יש reader שמסוגל לזהות את הסימון, ובקונטקסט שהוצג הוא קשור לאקטיבציה של שעתוק.

כשצובעים עובר בשלב ארבעת התאים ל־H3R26me, רואים שבמבנה טטרהדרלי מסוג ME/EM התאים נצבעים בעוצמה שונה; יש תא עם רמה גבוהה יותר של הסימון, ואחרים עם רמות נמוכות יותר.

ההבדל מופיע בצורה ספציפית: הוא קשור למודיפיקציה מסוימת, בשלב ארבעת התאים, ובחלוקה לא שווה בין הבלסטומרים. כלומר, לא מדובר בשינוי אפיגנטי כללי, אלא בסימון מסוים שיכול ליצור הטיה מוקדמת בין התאים.

האנזים שעושה את המתילציה - Carm1

האנזים שמבצע את המתילציה הוא Carm1. בצביעה ל־Carm1 בעובר של ארבעה תאים, רואים שיש תא שמבטא יותר Carm1 מתאים אחרים. הדבר מתאים לרעיון שיש קשר בין רמות Carm1 לבין רמות H3R26me.

אבל קורלציה לא מספיקה. השאלה הבאה היא אם ההבדל משפיע על ההתפתחות.

העלאת Carm1 בתא אחד

בניסוי מזריקים לתא אחד בעובר של שני תאים:

• mRNA שמקודד לסמן אדום, כדי לעקוב אחרי צאצאי התא
• mRNA שמקודד ל־Carm1, כדי להעלות את רמות ה־Carm1 בתא

כשבודקים את הבלסטוציסט, התאים האדומים נמצאים בעיקר ב־ICM וכמעט לא ב־Trophectoderm.

המסקנה היא שהעלאת Carm1 בתא, מטה את הצאצאים לכיוון פנימי/ICM. כדי שתא יהיה פנימי, הוא צריך להוריד את Cdx2. לכן, Carm1 והמתילציה הקשורה אליו משתתפים בהטיית ה־First cell fate decision.

חשוב לדייק: הניסוי לא אומר שכל גורל התא נקבע רק על ידי Carm1. הוא מראה ש־Carm1 יכול להטות את הפוטנציאל ההתפתחותי של התא.

Long non-coding RNAs ו־LincGET

כדי להבין למה Carm1 פעיל בצורה שונה בין תאים, צריך להכיר Long non-coding RNAs.

Long non-coding RNA הוא RNA שאינו מקודד לחלבון ואורכו מעל 200 נוקלאוטידים.

C-value paradox ו־G-value paradox

LincGET

LincGET הוא long non-coding RNA. הוא לא מקודד לחלבון, אבל יש לו תפקיד רגולטורי. הוא מופיע בשלב מוקדם מאוד של ההתפתחות.

כמה LincGET מתבטא בכל שלב

כשמודדים את LincGET לאורך ההתפתחות, רואים שהוא כמעט לא מתבטא באואוציט, עולה אחרי Zygotic genome activation, מגיע לפיק סביב שלב שניים-ארבעה תאים, ובהמשך יורד.

בבדיקה ברמת תא בודד, LincGET לא מתבטא באותה רמה בכל הבלסטומרים. לעומת זאת, גן ביקורת מסוג housekeeping gene, כמו Hprt, מתבטא בצורה דומה בין התאים. לכן ההבדל לא נובע מבעיה כללית במדידה, אלא תכונה של LincGET.

ב־RNA-FISH רואים ש־LincGET נמצא בעיקר בגרעין. זה מתאים לכך שהוא לא mRNA רגיל שמיועד לצאת לציטופלזמה ולעבור תרגום לחלבון, אלא RNA רגולטורי שפועל בגרעין.

הנקודה המרכזית: כבר בשלב שני התאים, מיד אחרי ZGA, יש הבדל ברמות LincGET בין הבלסטומרים. זה מוקדם יותר מההבדלים הברורים ב־Carm1 וב־H3R26me שנראים במיוחד בשלב ארבעת התאים.

המודל: LincGET, Carm1, Sox2/Nanog ו־Cdx2

מתברר ש־Carm1 לא מספיק בפני עצמו. כדי להיות פעיל, Carm1 צריך לקשור את LincGET. כלומר, LincGET ו־Carm1 יוצרים קומפלקס, והקומפלקס מאפשר ל־Carm1 לבצע מתילציה על H3R26.

הקשר בין כל הרכיבים:

LincGET
  ↓ binds
Carm1 activation
  ↓
H3R26me
  ↓
activation of Sox2 / Nanog
  ↓
repression of Cdx2
  ↓
Bias toward ICM / inner-cell fate

אם LincGET מתבטא ברמה גבוהה יותר בתא מסוים, Carm1 יהיה פעיל יותר באותו תא. פעילות Carm1 מובילה ליותר H3R26me, והסימון הזה מאפשר ביטוי של גנים כמו Sox2 ו־Nanog.

כאשר Sox2 ו־Nanog עולים אפילו מעט, הם יכולים להשפיע על רשת פקטורי השעתוק:

• Sox2 ו־Nanog תומכים בכיוון ICM/פלוריפוטנטיות
• Sox2 יכול להעלות גם את Sox21
• Sox21 משתתף בדיכוי Cdx2
• ירידת Cdx2 מאפשרת לתא ללכת לכיוון פנימי יותר

המודל המסכם:

1. בשלב שני התאים יש כבר הבדל ברמות LincGET בין שני הבלסטומרים.
2. Carm1 נמצא בשני התאים, אבל פעילותו תלויה ב־LincGET.
3. תא עם יותר LincGET מפעיל יותר Carm1.
4. Carm1 יוצר יותר H3R26me.
5. H3R26me מאפשר ביטוי של Sox2/Nanog.
6. Sox2/Nanog מורידים את Cdx2.
7. ירידת Cdx2 מטה את התא לכיוון ICM.

זה מודל של הטיה התחלתית: LincGET ו־Carm1 מעלים את הסיכוי למסלול ICM, וכך מתחילה שבירת סימטריה בעובר שנראה בתחילה סימטרי.

פולריזציה ו־Compaction: קשורים אך בלתי תלויים

חזרנו לקשר בין Polarization לבין Compaction.

בשיעור הקודם הובהר שפולריזציה וקומפקשן מתרחשים סביב שלב שמונת התאים, ושניהם קשורים ל־First cell fate decision. כאן מתחדדת הנקודה שהם קשורים זה לזה, אבל אינם אותו תהליך ואינם תלויים לחלוטין זה בזה.

איך נוצרת פולריזציה?

בתהליך הפולריזציה, פילמנטים של אקטין מתחילים להתארגן באזור האפיקלי, ובהמשך מגויסים חלבוני apical polarity complex. הגיוס מתחיל באזור מרכזי של הממברנה האפיקלית, ולאחר מכן החלבונים נדחפים לצדדים ונוצרת טבעת actomyosin.

בתהליך משתתפים בין היתר:

לאחר Zygotic genome activation, Tfap2c ו־Tead4 מתחילים להתבטא. הרמות שלהם עולות עד לסף מסוים, וסביב שלב שמונת התאים מתרחשת פולריזציה.

הטיית המקרה - לגרום לפולריזציה להתרחש בארבעה תאים

בניסוי, מזריקים לזיגוטה mRNA שמקודד ל־Rho, Tfap2c ו־Tead4. כך מעלים מוקדם את רמות החלבונים, לפני הזמן שבו הם היו עולים באופן טבעי אחרי ZGA.

התוצאה: הפולריזציה יכולה להתרחש כבר בשלב ארבעת התאים.

מכאן שפולריזציה לא תלויה לחלוטין בקומפקשן. אפשר להקדים אותה בניסוי. מצד שני, בבלסטומר רגיל, בתוך עובר, קומפקשן ו־Adherens junctions עוזרים לכוון את הפולריות לצד האפיקלי (הצד שפונה החוצה / לכיוון ה־Zona Pellucida).

אם מפרידים תאים ושמים אותם בצלחת, הם עדיין יכולים להפוך לפולריים, אבל כיוון הפולריות יהיה אקראי יותר. לכן:

פולריזציה יכולה להתרחש גם בלי קומפקשן, אבל קומפקשן עוזר למקם את הפולריות במקום הנכון בתוך העובר.

רצף האירועים המרכזי

Zygote / one-cell embryo
  ↓
Animal-vegetal axis defined by polar body
  ↓
First cleavage roughly parallel to animal-vegetal axis
  ↓
2-cell embryo
  ├─ LincGET appears asymmetrically after ZGA
  └─ Carm1 protein may be present, but activity depends on LincGET
  ↓
4-cell embryo
  ├─ Different division patterns: ME/EM, MM, EE
  ├─ ME/EM is most frequent → probabilistic, not stochastic
  ├─ H3R26me appears asymmetrically in tetrahedral embryos
  └─ Carm1/H3R26me biases cells toward Sox2/Nanog and lower Cdx2
  ↓
8-cell embryo
  ├─ Compaction
  ├─ Polarization
  └─ Different Cdx2 levels between cells
  ↓
First cell fate decision
  ├─ Higher Cdx2 / polarity / outer position
  │    ↓
  │  Trophectoderm
  │
  └─ Lower Cdx2 / Sox2-Nanog bias / inner position
       ↓
     ICM

משפטי מפתח

• שבירת סימטריה מתחילה לפני שרואים הבדל מורפולוגי ברור בין התאים.
• ביונקים ההתפתחות רגולטיבית, ועדיין בלסטומרים מוקדמים יכולים להיות שונים בפוטנציאל.
• ההבדלים בין בלסטומרים מוקדמים הם בעיקר הטיות פרובביליסטיות: הם משנים הסתברויות, בלי לנעול גורל סופי.
• מישור החלוקה הראשון מקביל בקירוב לציר animal-vegetal, ולכן כבר בזיגוטה יש כיוון מרחבי חשוב.
• Cell lineage analysis מראה שאין ערבוב גדול של צאצאי שני הבלסטומרים, ושהציר embryonic-abembryonic קשור לציר animal-vegetal.
• שני הבלסטומרים הראשונים אינם שקולים מבחינת פוטנציאל התפתחותי.
• ההבדל העיקרי בין twin ו־co-twin קשור ליכולת לייצר ICM/Epiblast, ובמיוחד למספר תאי Nanog+.
• בשלב ארבעת התאים, סוגי החלוקה ME/EM, MM ו־EE אינם מופיעים בשכיחות שווה; זהו דפוס פרובביליסטי.
• H3R26me הוא אירוע אפיגנטי ספציפי שמופיע ברמות שונות בין בלסטומרים.
• Carm1 מטה תאים לכיוון פנימי/ICM, כנראה דרך H3R26me והפעלת Sox2/Nanog.
• LincGET הוא long non-coding RNA שמתבטא מוקדם, ברמות שונות בין בלסטומרים, ומפעיל את Carm1.
• פולריזציה ו־Compaction קשורים, אבל אינם זהים: פולריזציה יכולה להתרחש בלי קומפקשן, וקומפקשן עוזר למקם אותה בכיוון הנכון.