שיעור 7 שיעתוק, תרגום ובקרת ביטוי גנים

תוכן העניינים:

1. מבוא: למה צריך RNA כמתווך?
2. תהליך השיעתוק (Transcription)
3. עיבוד ה-mRNA
4. שחבור (Splicing)
5. תרגום (Translation)
6. בקרת ביטוי גנים
7. בקרה ברמת השיעתוק
8. בקרה ברמת התרגום
9. בקרה לאחר התרגום
10. סיכום רמות הבקרה
11. שאלות תרגול מג׳ונרטות

מבוא: למה צריך RNA כמתווך?

סיבות לקיום ה-mRNA

1. שמירה על ה-DNA: ה-DNA הוא המידע החשוב ביותר בתא. כל שינוי בו עשוי להשפיע על התכונות שלנו ולגרום למחלות כמו סרטן. לכן:
   • ה-DNA נשמר בגרעין (כמו בכספת)
   • מוגן על ידי ממברנה
   • לא בא במגע ישיר עם אנזימים בציטופלזמה

2. יעילות: ה-DNA הוא רצף ארוך מאוד. במקום לחבר את כל הכרומוזום לריבוזום, שולחים מקטעים קצרים וברורים של RNA.

3. הגברת ייצור: ניתן לייצר עותקים רבים של mRNA מאותו גן, ובכך לייצר כמויות גדולות של חלבון במהירות.

תהליך השיעתוק (Transcription)

מושגי יסוד

• גדיל Antisense - הגדיל שמשמש כתבנית ליצירת ה-mRNA (בכיווניות הפוכה)
• גדיל Sense - הגדיל שלא משמש כתבנית, אך דומה מאוד לרצף ה-RNA עצמו
• הערה חשובה: הגדיל שמשמש כ-Antisense אינו קבוע - עבור כל גן יש Antisense ספציפי שונה.

RNA פולימראז - “סופר-אנזים”

RNA פולימראז מבצע מספר פעולות:

1. פתיחה והפרדה בין גדילי ה-DNA (ללא צורך ב-Helicase)
2. חיבור נוקלאוטידים משלימים
3. אינו צריך פריימר להתחלת הסינתזה

מיקום השיעתוק

עיבוד ה-mRNA

יציבות ה-RNA

• RNA פחות יציב מ-DNA פי 100 בגלל:
  • חד-גדילי (לא דו-גדילי)
  • סוכר ריבוז (במקום דאוקסיריבוז)
  • בסיס U במקום T
• זמן מחצית חיים: דקות עד שעות (מקסימום יום-יומיים)
• יוצא דופן: mRNA בביציות - נשמר לאורך זמן רב

תוספות לקצוות ה-mRNA

Cap (קצה 5’)

• מולקולת GTP הקשורה הפוך לרצף
• אנזים: Guanyl Transferase
• תפקידים:
  • הגנה מפני אקסונוקלאזות
  • סימון כיווניות
  • זיהוי על ידי הריבוזום

זנב Poly-A (קצה 3’)

• רצף של כ-200 אדנינים (A)
• אנזים: Poly-A Polymerase
• ככל שהזנב ארוך יותר, ה-mRNA יציב יותר

שחבור (Splicing)

אקסונים ואינטרונים

• אקסונים - אזורים מקודדים (יישארו ב-mRNA הבשל)
• אינטרונים - אזורים לא מקודדים (נחתכים החוצה)

מאפייני רצף האינטרון

מנגנון השחבור - Spliceosome

• מורכב מ-snRNPs (Small Nuclear Ribonucleoproteins)
• יחידות: U1, U2, U4, U5, U6 (אין U3)
• התהליך דורש אנרגיה

הבדלים בין אורגניזמים

בפרוקריוטים אין אינטרונים כלל!

שחבור חליפי (Alternative Splicing)

• מאפשר יצירת חלבונים שונים מאותו גן
• לפעמים נחתכים אקסונים יחד עם האינטרונים
• יכול להיות ספציפי לרקמה

תרגום (Translation)

הקוד הגנטי

• 64 קומבינציות של קודונים (4³)
• 20 חומצות אמינו בלבד
• קודון התחלה: AUG (מתיונין)
• קודוני סיום: UGA, UAA, UAG

מיקום התרגום

• ריבוזומים על ה-ER - חלבונים ממברנליים או מופרשים
• ריבוזומים חופשיים - חלבונים ציטופלזמיים

tRNA

• נושא אנטי-קודון מצד אחד
• חומצת אמינו מצד שני
• מתווך בין שפת הנוקלאוטידים לשפת חומצות האמינו

בקרת ביטוי גנים

עקרון כללי

לא כל הגנים מתבטאים בכל תא:

• הבדלים בין סוגי תאים (עור vs. שריר)
• הבדלים לאורך החיים (תינוק vs. קשיש)
• הבדלים פיזיולוגיים (הריון vs. לא בהריון)

בקרה ברמת השיעתוק

1. פקטורי שיעתוק (Transcription Factors)

אזור הפרומוטור

• נמצא לפני הגן
• כולל TATA Box - רצף עשיר ב-T ו-A
• אתר קישור ל-RNA פולימראז

אזור ה-Enhancer

• רחוק יותר מהגן (upstream)
• יכול להשפיע דרך יצירת לולאה ב-DNA

סוגי פקטורים

• קיימים מעל 2,000 סוגים שונים של פקטורי שיעתוק
• כולם בעלי DNA Binding Domain

הבדלים בין פרוקריוטים לאאוקריוטים

2. אפיגנטיקה

מתילציה של DNA

• תוספת קבוצת מתיל ($\ce{CH3}$) לבסיסי $\ce{C}$ באזורי CpG
• אנזים: DNA Methyl Transferase
• מתילציה = עיכוב שיעתוק

מודיפיקציות של היסטונים

• מתילציה, אצטילציה, פוספורילציה
• משפיעות על צפיפות ה-DNA:
  • DNA פרוס = שיעתוק אפשרי
  • DNA מקובץ = שיעתוק מעוכב

תורשה אפיגנטית

• חלק מהמודיפיקציות עוברות לתאי בת
• חלק יכולות להשתנות מהשפעת הסביבה (תזונה, פעילות גופנית, מחלות)

3. מיקרו-רנ״א (miRNA)

• רצפים קצרים של RNA (23-21 בסיסים)
• לא מקודדים לחלבון - פעילים כ-RNA
• תפקיד: עיכוב ביטוי של גנים אחרים

תהליך היווצרות miRNA

1. שיעתוק ← Pri-miRNA
2. חיתוך על ידי Drosha (בגרעין)
3. יציאה מהגרעין על ידי Exportin-5
4. חיתוך על ידי Dicer (בציטופלזמה)
5. התחברות לקומפלקס RISC עם חלבון Argonaute (AGO2)
6. קישור ל-mRNA מטרה ← עיכוב תרגום/פירוק

שימושים רפואיים

• השתקת גנים בסרטן
• כשליש מהגנים תחת בקרת miRNA

בקרה ברמת התרגום

גורמים משפיעים

• כמות ריבוזומים
• זמינות קודון ההתחלה
• יציבות ה-mRNA
• קצב התרגום

סוגי בקרה

• Enhancers - מעודדי תרגום
• Inhibitors - מעכבי תרגום

בקרה לאחר התרגום

1. קיפול חלבונים

• חלק מתקפל באופן טבעי (מבנה שניוני ושלישוני)
• חלק בעזרת Chaperones (חלבוני Heat Shock)
• Chaperones רגישים לחום (בעיה בחום גבוה)

2. מודיפיקציות פוסט-תרגומיות

• פוספורילציה - הוספת זרחן (על ידי קינאזות)
• גליקוזילציה - הוספת סוכר
• הוספת שומנים
• חיתוך פרוטאוליטי

יתרון המודיפיקציות - הפעלה מהירה

• חלבונים יכולים להיות קיימים בתא אך לא פעילים
• רק לאחר מודיפיקציה (למשל פוספורילציה) הם הופכים לפעילים
• יתרון: כאשר נדרשת הפעלה/כיבוי מהירים של חלבון (בפרקי זמן קצרים), אין צורך לחכות לשיעתוק ולתרגום מחדש
• מספיק לבצע מודיפיקציה אחת כדי להפעיל או לכבות את החלבון
• מתאים לחלבונים שצריך “לשחק” איתם במינונים משתנים

מפלי איתות (Signal Cascades)

• לעיתים קרובות קישור ליגנד לרצפטור מפעיל מפל של אקטיבציות
• קינאזות - אנזימים שמעבירים זרחן לחלבונים אחרים
• חלבון אחד עובר אקטיבציה ← מפעיל חלבון שני ← מפעיל חלבון שלישי וכן הלאה

דוגמה: אינסולין

1. ייצור פרו-אינסולין בריבוזום
2. קיפול ב-ER
3. יצירת קשרי $\ce{S-S}$
4. מעבר לגולג’י
5. חיתוך על ידי פרוטאזות (אנזימים ספציפיים שחותכים חלבונים במקום מסוים)
6. ← אינסולין פעיל

משמעות: אינסולין הוא דוגמה לחלבון שגם אחרי השלמת שיעתוק ותרגום, הוא עדיין לא פעיל עד שעובר מודיפיקציות נוספות. זה מאפשר הזדמנויות נוספות לבקרה ולהפעלה רק כשבאמת יש צורך.

3. פירוק חלבונים - הפרוטאזום

• גילוי: פרופ’ אהרון צ’חנובר, אברהם הרשקו ופרופ’ אירווין רוז מקליפורניה (פרס נובל 2004)

מנגנון הפירוק

1. סימון החלבון בשרשרת יוביקויטין (3 מולקולות)
2. זיהוי על ידי הפרוטאזום
3. פירוק לפפטידים קצרים ולחומצות אמינו בודדות
4. מיחזור הרכיבים לבניית חלבונים חדשים

• התהליך דורש אנרגיה (ATP)
• משמש גם להגנה מפני פתוגנים (מפרק גם חלבונים שהגיעו ממקור חיצוני)
• הפרוטאזום הוא “תחנת מיחזור” לחלבונים בתא

חלבונים המיועדים לפירוק

• חלבונים זקנים
• חלבונים פגומים/שרופים
• חלבונים שאינם נחוצים יותר לתא

חשיבות קצב הפירוק

• גם אם נוצר הרבה חלבון מהר, אם הוא מתפרק מהר מאוד - הוא לא יישאר פעיל לאורך זמן
• קצב הפירוק משפיע על רמת החלבון הפעיל בתא

סיכום רמות הבקרה

עיקרון מרכזי: הבקרה ברמת השיעתוק היא הקריטית ביותר - אם לא צריך את החלבון, עדיף לא להתחיל את התהליך כלל. עם זאת, לאורך כל הדרך ואפילו אחרי שנוצר החלבון, עדיין אפשר ״לשחק״ עם הרמות שלו.

שאלות תרגול מג׳ונרטות

שאלות תרגול בגנטיקה על בסיס תרגול 5: הדוגמה המרכזית, שלבי בקרת ביטוי גנים, פרומוטור, פקטורי שעתוק, אפיגנטיקה, מתילציה, מודיפיקציות בהיסטונים, miRNA, Antisense RNA, בקרת תרגום, קיפול חלבונים, זירחון, יוביקוויטין-פרוטאוזום, SMA, טיפול גנטי.

שאלה 2: ביטוי גנים רקמה-ספציפי

האם כל החלבונים מתבטאים בכל תא בגוף?

1. כן - כל תא מבטא את כל הגנים, אך רק חלק מהחלבונים פעילים לאחר תרגום
2. לא - כל תא מבטא תת-קבוצה של גנים בהתאם לזהותו, בעוד שיתר הגנים מושתקים או מבוטאים ברמה זניחה
3. כן - כל תא מבטא את אותם גנים, אך ההבדל הוא רק בקצב פירוק ה-mRNA והחלבון
4. לא - תאים ממוינים כמעט לא מבטאים גנים, ורק תאי גזע מבצעים שעתוק פעיל

שאלה 3: שלבי בקרת ביטוי גנים

מהם שלושת שלבי הבקרה העיקריים של ביטוי גנים?

1. בקרה על שכפול DNA, בקרה על תיקון DNA, ובקרה על חלוקת התא
2. בקרה על שעתוק, בקרה על עיבוד/תרגום RNA, ובקרה לאחר יצירת החלבון
3. בקרה על ריצוף, בקרה על שחבור, ובקרה על טרנסלוקציה כרומוזומלית
4. בקרה על מתילציה, בקרה על אצטילציה, ובקרה על זירחון כחלק משלושת שלבי הבקרה העיקריים

שאלה 4: מבנה הפרומוטור

מהם רכיבים אופייניים שמעורבים בבקרת התחלת שעתוק של גן?

1. TATA box, CAAT box, GC box ורצפי בקרה שאליהם נקשרים פקטורי שעתוק
2. 5’ cap, Poly-A tail ואזורים ב-UTR שמווסתים יציבות ותירגום של mRNA
3. Kozak sequence, אתרי התחלת תרגום ורצפי קישור של תת-יחידת הריבוזום
4. רצפי אקסונים/אינטרונים ואתרי שחבור שקובעים איזה איזופורם חלבוני ייווצר

שאלה 5: פקטורי שעתוק - אקטיבטורים מול רפרסורים

מה ההבדל העקרוני בין Activator ל-Repressor בבקרת שעתוק?

1. Activator מגייס קו-אקטיבטורים/מייצב קומפלקס שעתוק; Repressor מפריע לגיוס/מגייס קו-רפרסורים ומקטין התחלת שעתוק
2. Activator נקשר רק ל-DNA דו-גדילי; Repressor נקשר רק ל-RNA חד-גדילי ולכן אינו פועל בשעתוק
3. Activator מעלה תרגום ע”י קישור ל-5’UTR; Repressor מוריד תרגום ע”י קישור ל-3’UTR
4. Activator קיים רק בפרוקריוטים; Repressor קיים רק באאוקריוטים ולכן אינם מקבילים פונקציונלית

שאלה 6: מתילציה של DNA - מנגנון השתקה

כיצד מתילציה של DNA יכולה להפחית ביטוי של גן?

1. מתילציה ב-CpG יכולה להפחית קישור של פקטורי שעתוק ולגייס חלבונים שמקדמים כרומטין דחוס ← ירידה בשעתוק
2. מתילציה מחליפה את בסיס C בבסיס U וכך נוצרת “מוטציית RNA” שמפסיקה תרגום ← ירידה בשעתוק
3. מתילציה מגדילה את פתיחת הכרומטין ומעלה גישה לפרומוטור ← עלייה בשעתוק
4. מתילציה מתרחשת רק על היסטונים ולא על DNA ולכן אינה משפיעה ישירות על שעתוק

שאלה 7: מודיפיקציות בהיסטונים - אצטילציה מול מתילציה

מהי ההשפעה השכיחה של אצטילציה על היסטונים?

1. אצטילציה מנטרלת מטען חיובי על ליזינים בזנבות היסטונים ← מפחיתה אינטראקציה עם DNA ← כרומטין פתוח יותר וביטוי עולה
2. אצטילציה מוסיפה מטען חיובי לזנבות היסטונים ← מחזקת קשירה ל-DNA ← כרומטין סגור וביטוי יורד
3. אצטילציה חותכת את זנבות ההיסטונים ← הנוקלאוזום מתפרק לחלוטין ← אין אריזת DNA בכלל
4. אצטילציה מתרחשת רק ב-DNA (לא בהיסטונים) ולכן אין לה קשר ישיר לאריזת כרומטין

שאלה 8: miRNA - מנגנון פעולה

כיצד miRNA מפחית ביטוי של גן מטרה?

1. miRNA נטען לקומפלקס חלבוני (כגון RISC) ונקשר ל-mRNA מטרה ← עיכוב תרגום ו/או פירוק mRNA
2. miRNA נקשר לפרומוטור ב-DNA ומעכב קשירה של RNA polymerase II ← ירידה בשעתוק
3. miRNA מתורגם לפפטיד קצר שנקשר לריבוזום ומפסיק elongation של התרגום
4. miRNA נקשר ישירות ל-tRNA וגורם לטעינת חומצת אמינו שגויה ← חלבון פגום ולכן “ירידה בביטוי”

שאלה 9: Antisense RNA

כיצד Antisense RNA יכול להשתיק ביטוי גן?

1. Antisense RNA מזווג בסיסים עם mRNA משלים ← מפריע לתרגום ויכול לקדם פירוק של ה-RNA
2. Antisense RNA נקשר ל-DNA באזור הפרומוטור ויוצר קשרים קוולנטיים שמונעים שעתוק
3. Antisense RNA נקשר לחלבון המטרה וגורם לו להתפרק בפרוטאוזום
4. Antisense RNA מעכב שחבור ע”י פירוק snRNPs בגרעין ומפסיק עיבוד mRNA בכל התא

שאלה 10: בקרת תחילת תרגום - Translation Initiation

מה יכול לווסת את קצב התחלת התרגום של mRNA?

1. קישור חלבונים/קומפלקסים ל-5’UTR ושינוי מבנים משניים או גיוס ריבוזום ← שינוי בקצב initiation
2. קישור חלבונים לקודון הסיום (Stop codon) ושינוי קצב termination ← שינוי בקצב initiation
3. שינוי ברצף ה-DNA בפרומוטור בזמן אמת לפי תנאי סביבה ← שינוי מיידי במהירות initiation
4. פירוק שרשראות יוביקוויטין מהחלבון המתורגם ← שינוי ישיר בקצב initiation על אותו mRNA

שאלה 11: קיפול חלבונים - צ׳פרונים

מה תפקידם העיקרי של צ׳פרונים?

1. סיוע לקיפול חלבונים ומניעת אגרגציה, במיוחד בתנאי עקה; חלקם גם מסייעים בקיפול מחדש
2. חיתוך חלבונים לפפטידים כחלק קבוע מתהליך התרגום בריבוזום
3. קישור ל-DNA באזור הפרומוטור ופתיחת כרומטין כדי להתחיל שעתוק של גנים
4. הוספת קבוצות פוספט ל-Ser/Thr/Tyr כדי להפעיל מסלולי העברת אותות

שאלה 12: זירחון חלבונים (Phosphorylation)

באילו חומצות אמינו נפוץ זירחון, ומה תפקידו?

1. Serine/Threonine/Tyrosine - שינוי פעילות/קישור/לוקליזציה כחלק מבקרת מסלולי איתות
2. Glycine/Alanine/Valine - יצירת קשרי דיסולפיד וייצוב מבנה שלישוני
3. Methionine/Tryptophan/Phenylalanine - קביעת תחילת תרגום ועצירת elongation
4. Lysine/Arginine/Histidine - סימון חלבון לפירוק בפרוטאוזום ע”י יוביקוויטין

שאלה 13: מערכת יוביקוויטין-פרוטאוזום

מה מתאר נכון פירוק חלבונים תלוי יוביקוויטין?

1. קישור יוביקוויטין לחלבון (לעיתים כשרשרת) מסמן אותו לזיהוי בפרוטאוזום ולפירוק לפפטידים/חומצות אמינו
2. יוביקוויטין הוא פרוטאז שמפרק חלבונים ישירות בציטוזול ללא צורך בקומפלקס נוסף
3. פרוטאוזום מוסיף יוביקוויטין לחלבון המטרה, ואז מעביר אותו לגרעין כדי להפסיק שעתוק
4. יוביקוויטין נקשר ל-mRNA של הגן וכך מפחית את תרגומו ע”י ריבוזומים

שאלה 14: יציבות חלבונים - N-Terminal Rule

ממה יכולה להיות מושפעת יציבות חלבון לפי עקרון ה-N-end rule?

1. זהות חומצת האמינו בקצה ה-N-טרמינלי יכולה להשפיע על זיהוי החלבון במסלולי פירוק ועל זמן מחצית החיים שלו
2. רק אורך החלבון קובע: חלבונים ארוכים תמיד מתפרקים מהר יותר מחלבונים קצרים
3. רק מספר קשרי דיסולפיד קובע: יותר קשרים = תמיד יותר פירוק בפרוטאוזום
4. רק סוג התאים קובע: באותו תא כל החלבונים יציבים באותה מידה, בלי תלות ברצף

שאלה 15: SMA - הבדל בין SMN1 ל-SMN2

מה ההבדל המרכזי בין SMN1 ל-SMN2 ומדוע SMN2 לרוב לא מפצה לחלוטין?

1. שינוי נקודתי ב-SMN2 משפיע על שחבור כך שאקסון 7 מדולג לעיתים קרובות ← פחות חלבון מלא תפקודי ביחס ל-SMN1
2. SMN2 אינו מתועתק כלל ברקמות עצביות, בעוד SMN1 מתועתק רק בשריר
3. SMN1 נמצא בכרומוזום אוטוזומלי ו-SMN2 בכרומוזום X ולכן אין אפשרות לפיצוי ביניהם
4. SMN2 מייצר רק rRNA שקשור לריבוזום ולא חלבון, ולכן אין לו קשר ל-SMN

שאלה 16: SMA - טיפול ב-Zolgensma

על מה מבוסס הטיפול ב-Zolgensma ומדוע יעילותו מוגבלת כאשר מתחילים מאוחר?

1. החדרת עותק תפקודי של SMN1 בעזרת וקטור (כגון AAV); התחלה מאוחרת פחות יעילה כי נזק נוירונלי מצטבר אינו הפיך במלואו
2. הגברת תרגום של SMN2 ע”י קישור חלבון ל-3’UTR; התחלה מאוחרת לא יעילה כי mRNA כבר התפרק
3. השתקת אונקוגן שמעכב נוירונים מוטוריים; התחלה מאוחרת לא יעילה כי הפרומוטור כבר ממותל
4. פירוק מיוחד של חלבונים רעילים בעזרת פרוטאוזום; התחלה מאוחרת לא יעילה כי יוביקוויטין נגמר בתא

שאלה 17: אפיגנטיקה - תאומים זהים

האם תאומים זהים שגדלו בסביבות שונות צפויים לשמור על דגם אפיגנטי זהה?

1. לא בהכרח - DNA זהה, אך גורמי סביבה וגיל יכולים לשנות מתילציה/מודיפיקציות היסטונים ולהוביל להבדלים
2. כן - אפיגנטיקה נקבעת רק בזמן ההפריה ולכן אינה משתנה במהלך החיים
3. כן - תאומים זהים זהים גם אפיגנטית בכל הרקמות כי הכרומטין מועתק במדויק כמו DNA
4. לא - תאומים זהים אינם חולקים את אותו DNA ולכן בהכרח גם האפיגנטיקה שונה

שאלה 18: miRNA וסרטן

כיצד ירידה ב-miRNA מסוים יכולה לתרום להתפתחות סרטן?

1. אם miRNA מדכא אונקוגן, ירידה בו מסירה דיכוי ← ביטוי יתר של אונקוגן וחלוקה לא מבוקרת
2. אם miRNA מדכא מדכאי-גידול, ירידה בו תעצים מדכאי-גידול ולכן תגרום לסרטן
3. miRNA פועל רק בעובר ולכן ירידה בו אינה משפיעה על גידולים בבוגר
4. miRNA הוא אנזים שמפרק DNA; ירידה בו גורמת להצטברות DNA ולסרטן

שאלה 19: חישוב גודל חלבון מגודל גן

רצף מקודד (coding sequence) באורך 900 בסיסים. מהו הגודל המקסימלי של הפפטיד שניתן לקודד ממנו?

1. כ-300 חומצות אמינו (בקירוב), משום שכל 3 בסיסים = קודון אחד שמקודד לחומצת אמינו אחת
2. כ-450 חומצות אמינו (בקירוב), משום שכל 2 בסיסים = קודון אחד בתרגום
3. כ-900 חומצות אמינו (בקירוב), משום שכל בסיס מקודד ישירות לחומצת אמינו אחת
4. כ-150 חומצות אמינו (בקירוב), משום שכל 6 בסיסים נדרשים לקידוד חומצת אמינו אחת

שאלה 20: יתרון בקרה מוקדמת מול מאוחרת

מהו היתרון של בקרה ברמת השעתוק לעומת בקרה לאחר תרגום?

1. בקרה ברמת השעתוק לרוב חסכונית יותר באנרגיה; בקרה לאחר תרגום מאפשרת תגובה מהירה יותר כי החלבון כבר קיים
2. בקרה ברמת השעתוק תמיד מהירה יותר כי אין צורך בריבוזומים; בקרה לאחר תרגום תמיד איטית כי דורשת שעתוק מחדש
3. בקרה לאחר תרגום תמיד חסכונית יותר כי לא נוצרים חלבונים כלל; בקרה ברמת השעתוק תמיד בזבזנית
4. אין הבדל עקרוני: כל רמות הבקרה זהות בזמן תגובה ובעלות אנרגטית