תוכן עניינים:
- מהי ביוטכנולוגיה
- למה דווקא מיקרואורגניזמים
- שני סוגי תוצרים: מטבוליטים ראשוניים ושניוניים
- המעבר לביוטכנולוגיה רקומביננטית
- DNA רקומביננטי ופלסמידים
- יישומים רפואיים
- ייצור אינסולין רקומביננטי - הדוגמה המרכזית
- פרויקטים יישומיים מהמעבדה
- סיכום
מהי ביוטכנולוגיה
ביוטכנולוגיה היא ייצור חומרים בעזרת אורגניזמים חיים, ובפרט בעזרת מיקרואורגניזמים - חלקם עברו שינוי גנטי (GMO) וחלקם לא. כשהעבודה נעשית עם צמחים או בעלי חיים, נהוג לקרוא לכך “חקלאות”; כשמדובר בתאים ומיקרואורגניזמים, קוראים לכך “ביוטכנולוגיה”. העיקרון אחד: כיוון מערכת חיה לייצר תוצר רצוי.
למה דווקא מיקרואורגניזמים
לרבים מהמיקרואורגניזמים יש מסלולים מטבוליים רחבים - הם מסוגלים לסנתז כמעט כל מה שהם צריכים מחומרי גלם פשוטים. כל מה שחיידק דורש הוא מקור פחמן אורגני (בדרך כלל סוכר), יסודות כמו חנקן, גופרית וזרחן, ומקבל אלקטרונים להפקת אנרגיה (לרוב חמצן). מכל אלה הוא מייצר ביומסה, CO₂ ומים.
בני אדם, לעומת זאת, לא מסוגלים לייצר את כל חומצות האמינו - כעשר מהן הן חיוניות ויש לצרוך אותן מהמזון. חיידקים רבים מסוגלים לסנתז את כולן בעצמם.
שני סוגי תוצרים: מטבוליטים ראשוניים ושניוניים
מטבוליטים ראשוניים (Primary Metabolites)
חומרים שהם חלק מהמטבוליזם הבסיסי של התא - חומצות אמינו, ויטמינים, חומצות אורגניות ואלכוהול.
דוגמאות מהתעשייה: חומצה גלוטמית (מונוסודיום גלוטמט, MSG) מיוצרת בעזרת מיקרואורגניזמים, וכך גם ויטמיני B שונים (B₁₂, B₂) וחומצות אורגניות כמו חומצה ציטרית וחומצה לקטית. במרבית המקרים מדובר באורגניזמים טבעיים, שעברו לכל היותר השבחה - ולא שינוי גנטי ממשי.
מטבוליטים שניוניים (Secondary Metabolites)
חומרים שאינם חיוניים לקיום הבסיסי של התא, אך מעניקים לו יתרון בסביבה הטבעית. הדוגמה החשובה ביותר: אנטיביוטיקות.
אנטיביוטיקה מיוצרת בטבע גם על ידי חיידקים וגם על ידי פטריות, וזהו כלי תחרות בסביבות צפופות. עמידות לאנטיביוטיקה קיימת אף היא בטבע, כחלק מ”מרוץ חימוש” אבולוציוני - השימוש האנושי מאיץ אותה אך לא יצר אותה.
מדוע מייצרים אנטיביוטיקות באמצעות מיקרואורגניזמים ולא בסינתזה כימית? המבנים הכימיים מורכבים עד כדי כך שסינתזה מלאה תהיה יקרה מאוד ולא יעילה. הדרך המעשית היא גידול האורגניזם בתנאים שמקדמים ייצור, ולאחר מכן ניקוי התוצר.
המעבר לביוטכנולוגיה רקומביננטית
הדוגמה המרכזית (Central Dogma)
DNA → RNA → חלבון - זהו הציר האוניברסלי. מכיוון ש-DNA הוא מולקולה אוניברסלית, אפשר באופן עקרוני לקחת גן ממקור אחד ולבטא אותו במערכת אחרת. כך, למשל, מייצרים אינסולין אנושי בחיידקים, וחיסוני mRNA לקורונה פועלים על ידי כך שתאים שלנו מתרגמים RNA סינתטי לחלבון.
שתי מהפכות טכנולוגיות
ריצוף DNA (קריאה) - התחיל להתפתח בשנות ה-60, ובהמשך הגיעו טכנולוגיות NGS. העלויות צנחו: פרויקט הגנום האנושי (סביב שנת 2000) עלה מיליארדים, בעוד שהיום ריצוף גנום שלם עולה פחות מ-$1,000.
סינתזת DNA (כתיבה) - אפשרות לחבר נוקלאוטידים ולייצר רצפים סינתטיים. כיום אפשר לתכנן רצף, לשלוח הזמנה לחברה, ולקבל מולקולת DNA סינתטית בדואר תוך ימים.
המגבלה: עדיין לא מבינים הכול
אנחנו מבינים היטב את האזורים המקודדים (קודונים ← חומצות אמינו), אך בגנומים גדולים של רב-תאיים יש אזורים נרחבים שתפקידם עדיין לא ברור. בחיידקים, אחוז גבוה יותר מהגנום מקודד, ולכן ההבנה הפונקציונלית טובה יותר. כלים חישוביים כמו AlphaFold מסייעים בניבוי מבנה חלבונים, אך רחוקים עדיין מהבנה מלאה.
DNA רקומביננטי ופלסמידים
DNA רקומביננטי הוא מולקולת DNA שלא הייתה קיימת בטבע, אלא הורכבה משילוב מקטעים ממקורות שונים.
הכלי המרכזי הוא הפלסמיד - אלמנט DNA המשתכפל באופן עצמאי בחיידק ויכול לעבור בין חיידקים. אנחנו משתמשים בפלסמיד כוקטור: מכניסים לתוכו את הגן הרצוי, מחדירים את הפלסמיד לחיידק, והחיידק מבטא את החלבון המקודד. פלסמידים נפוצים לביטוי חלבונים בנויים מרכיבים שמקורם באורגניזמים שונים - כולל רצף המאפשר שכפול ב-E. coli ורכיבי בקרה נוספים.
יישומים רפואיים
חיסונים
הביוטכנולוגיה מאפשרת מספר אסטרטגיות חיסון: מיקרואורגניזם מומת, מיקרואורגניזם מוחלש, או חלבון ספציפי המיוצר במערכת רקומביננטית ומוזרק כדי לעורר תגובה חיסונית.
לדוגמה, חלבוני מעטפת של נגיפי הפטיטיס ופפילומה מיוצרים בשמרים. בחיסון לפפילומה משתמשים בגישה של VLP (Virus-Like Particles): חלבונים שנארזים למבנה הדומה לנגיף אך ללא חומר גנטי בפנים.
חלבונים טיפוליים ונוגדנים
תעשיית החלבונים הרקומביננטיים היא ענקית, והמוצר המתפתח ביותר בה הוא נוגדנים מונוקלונליים.
התאמת מערכת הייצור לחלבון
ביטוי של חלבון רקומביננטי הוא תהליך לא טריוויאלי. קיפול לא תקין, בעיות מסיסות, חוסר יציבות, או צורך במודיפיקציות לאחר תרגום (כגון גליקוזילציה) עלולים למנוע קבלת חלבון פעיל. לכן נהוג לעבור בין מערכות ביטוי: אם חיידקים לא מצליחים - מנסים שמרים, תאי חרקים, או תאי יונקים. נוגדנים, לדוגמה, לא מקבלים את המבנה הנכון בחיידקים, ולכן מייצרים אותם בתאי יונקים.
ייצור אינסולין רקומביננטי - הדוגמה המרכזית
רקע פיזיולוגי
אינסולין הוא הורמון חלבוני המופרש מתאי בטא בלבלב, ותפקידו ויסות רמות הסוכר בדם. פגיעה בתאי בטא גורמת לסוכרת מסוג 1 (תלויית אינסולין). היקף הסוכרת בעולם הולך ועולה.
הבשלת האינסולין בתא
החלבון מסונתז כ-Pre-pro-insulin הכולל פפטיד סיגנל. ב-ER נוצרים גשרים דיסולפידיים, ובגולג’י מתבצעים חיתוכים פרוטאוליטיים: שרשרת C מוסרת, ונותרות שרשרת A ו-B המחוברות בגשרים דיסולפידיים - זו הצורה הפעילה.
בגוף, אינסולין נארז עם אבץ כהקסאמר (שש יחידות), אך הצורה הנקשרת לרצפטור היא מונומר. ראוי לציין שמוטציות ברצפטור לאינסולין יכולות אף הן לגרום לבעיות בוויסות הסוכר - ובמקרה כזה, מתן אינסולין לא יפתור את הבעיה.
ההפקה ההיסטורית מבעלי חיים
אינסולין שמור יחסית בין מינים: שרשראות A ו-B דומות מאוד, ושרשרת C (שאינה חלק מהצורה הפעילה) משתנה יותר. בעבר הפיקו אינסולין מלבלב של כלבים, פרות וחזירים. השיטה סבלה מבעיות חמורות: כמויות ייצור נמוכות (ב-1980, הפקת 500 גרם דרשה מספר עצום של לבלבים), שונות בין אצוות, תגובות אלרגיות, נוגדנים, סיכון לזיהום, ופרופיל פעולה קצר.
פריצת הדרך: Genentech, 1979
המאמר מ-1979 הציג אסטרטגיה הנדסית פורצת דרך. במקום לנסות לייצר אינסולין פעיל ישירות - תהליך מורכב מדי - ייצרו את שרשרת A ו-B בנפרד, כל אחת בחיידק ובפלסמיד משלה.
הפפטידים הקצרים לא מתבטאים ביעילות כשלעצמם, ולכן חיברו כל שרשרת לחלבון חיידקי גדול שמתבטא בשפע (“גורר” את הפפטיד הקטן איתו). לאחר הביטוי, הפרידו את שרשרת האינסולין מהחלבון הנושא על ידי חיתוך כימי בציאנוגן ברומיד (חותך אחרי מתיונין), המיסו את החלבון בתנאים מפרקי-מבנה (אוריאה), וביצעו קיפול מחדש ויצירת גשרים דיסולפידיים לקבלת חלבון פעיל.
אימות הפעילות
הפעילות נבדקה ב-Radioimmunoassay: נוגדן הקושר אינסולין, אינסולין מסומן רדיואקטיבית, ואינסולין לא-מסומן שמתחרה על הקשירה. השינוי ברדיואקטיביות מעיד על פעילות הקשירה. נמצא שנדרשות שתי השרשראות יחד ביחס מתאים - כל אחת לבדה חסרת פעילות.
המצב התעשייתי כיום
כמה חברות גדולות מייצרות אינסולין רקומביננטי - Eli Lilly, Novo Nordisk ו-Sanofi - כל אחת במערכות שונות (חיידקים או שמרים). כיום משנים גם את הפורמולציה כדי לשלוט בקצב פירוק ההקסאמרים, ובכך מייצרים גרסאות מהירות פעולה לעומת ארוכות פעולה.
שאלה שעלתה בכיתה: האם אפשר להנדס חיידקים שייצרו אינסולין ישירות בתוך הגוף? קיימים ניסיונות, אך הבעיות רבות: הגוף מתייחס לחיידקים כפולשים, חלבונים מתפרקים במערכת העיכול, ופרוביוטיקה לרוב אינה מתבססת במעי לאורך זמן. גישה זו רלוונטית אולי למולקולות אחרות, אך לא לחלבונים כמו אינסולין.
פרויקטים יישומיים מהמעבדה
הנדסת אנזימים לייצור סיבים תזונתיים
המטרה: ייצור פולימרים של סוכרים שמערכת העיכול העליונה אינה מפרקת, כך שהם מגיעים שלמים אל המעי הגס. שם מבצע המיקרוביום מטבוליזם של הסיבים, ובתהליך עשוי לשנות את הרכב אוכלוסיות החיידקים.
האנזימים המשמשים לקחת סוכרוז (גלוקוז + פרוקטוז) ולבצע שתי פעולות: הידרוליזה רגילה, או - בתנאים מסוימים - העברת פרוקטוז מסוכרוז אחד לאחר ויצירת שרשראות באורכים שונים. השאלה המחקרית: כיצד אורך הסיב משפיע על הרכב המיקרוביום - מי “מעדיף לאכול” איזה סיב, ומה ההשלכות הבריאותיות.
הנדסת E. coli לייצור טאגטוז (Tagatose)
טאגטוז הוא סוכר נדיר - אינו מצטבר בכמויות גדולות בטבע ולכן יקר. מבחינת תכונות הוא מפתה מאוד: מתיקות דומה לסוכר, ערך קלורי של כ-30% בלבד, ומדד גליקמי נמוך ביותר (קרוב ל-1). הבעיה היחידה היא שאין תהליך ייצור יעיל.
הרעיון: שימוש בלקטוז מפסולת מי גבינה והמרת רכיב הגלקטוז שבו למסלול שמייצר טאגטוז. לשם כך יש למחוק גנים, להכניס מסלולים מאורגניזמים אחרים, ולגרום לחיידק לתפקד עם המסלול החדש. לאחר שנות עבודה הגיעו לחיידקים שמייצרים כמויות משמעותיות, והעבודה ממשיכה.
הפרויקט המרכזי: הנדסת חיידקים לייצור מתיונין
למה מתיונין
מתיונין היא חומצת אמינו חיונית - הגוף אינו מסוגל לסנתז אותה. היא אחת משתי חומצות האמינו המכילות גופרית (השנייה: ציסטאין). גופרית זמינה בטבע בעיקר כסולפט, אך הכנסתה למולקולה אורגנית דורשת חיזור - תהליך יקר מבחינה אנרגטית. לכן מיקרואורגניזמים “חסכניים” בייצור מתיונין.
בחקלאות, מתיונין מהווה גורם מגביל בתזונת דגים, עופות וחזירים, ולכן מוסיפים אותה למזון. כיום היא מיוצרת בעיקר בדרך כימית - תהליך יקר, מייצר פסולת ומלחים בעייתיים, ומניב תערובת של D-מתיונין ו-L-מתיונין, בעוד שהגוף זקוק ל-L בלבד.
שני מסלולים להכנסת גופרית
Trans-sulfurylation - גופרית מוכנסת תחילה לציסטאין, ומשם מועברת למתיונין. זהו המסלול ב-E. coli.
Direct-sulfurylation - גופרית מוכנסת ישירות למסלול ייצור המתיונין (דרך הומוסרין). חיידקים רבים אחרים משתמשים בגישה זו.
ארבעת שלבי ההנדסה
שלב 1 - יצירת אוקסוטרוף למתיונין. מחקו שני אנזימים מרכזיים במסלול ה-Trans (ΔMetAB), וכך החיידק איבד את היכולת לייצר מתיונין. בניסוי: הזן הטבעי (WT) גדל במצע מינימלי ללא תוספת, ואילו המוטנט גדל רק כשהוסיפו מתיונין מבחוץ.
שלב 2 - החלפת מסלול. הכניסו זוגות גנים מהמסלול ה-Direct, ממקורות חיידקיים שונים, על פלסמיד. לא כל הזוגות תפקדו ב-E. coli - גם כאלה שפעילים באורגניזם המקורי - אך חלקם החזירו גדילה כמעט ברמה של WT.
שלב 3 - מדידת ייצור. מדדו מתיונין בתוך התא ובמדיום. נרשם שיפור ניכר בכמות המתיונין, אם כי במחיר של ירידה קלה בקצב הגדילה.
שלב 4 - הסרת בקרה והוספת יצוא. מחקו את גן הבקרה metJ (המדכא ביטוי כאשר ריכוז המתיונין גבוה), וכן הוסיפו טרנספורטר המוציא מתיונין מהתא - מה שמפחית את הריכוז הפנימי ומונע עיכוב משוב (feedback inhibition).
השילוב של שלושת המהלכים - החלפת מסלול, מחיקת בקרה, הוספת טרנספורטר - הביא לכמויות ייצור גבוהות משמעותית.
מסקנה תעשייתית: למרות השיפור המדעי המשמעותי, הייצור הביולוגי של מתיונין אינו משתלם עדיין מבחינה מסחרית לעומת הייצור הכימי.
אבולוציה מכוונת (Directed Evolution)
שאלה מדעית פתוחה: מדוע אנזימים דומים ממקורות שונים מצליחים או נכשלים ב-E. coli? האם הבעיה בפעילות הקטליטית, ברמת הביטוי, ביציבות, או באינטראקציות בתוך התא?
הגישה: מערכת סלקציה פשוטה שבה E. coli אוקסוטרוף למתיונין ימות ללא מתיונין, ווריאנט משופר ישרוד. מבצעים מחזורים של מוטגנזה אקראית, הכנסה לחיידקים, גידול ללא מתיונין, בחירת שורדים, וריצוף לזיהוי המוטציות - וכך לומדים מה בדיוק צריך להשתנות כדי שהמסלול החדש יתפקד.
תובנת עומק: “תא זה לא מבחנה”
קל לדמיין חיידק כמעין שקית מים שמרחפים בה אנזימים ומטבוליטים. במציאות, פנים התא צפופים ביותר - DNA, חלבונים ומטבוליטים ארוזים בצפיפות שמשפיעה על כל תגובה. יש עדויות שאנזימים במסלולים מטבוליים עובדים כקומפלקסים מאורגנים (scaffolds), ולא כמולקולות בודדות. בגליקוליזה, למשל, אנזימים מאורגנים על מבנה פיזי - אך ברוב המסלולים האחרים הארגון עדיין לא ידוע.
המסקנה להנדסה מטבולית: לא מספיק “להכניס גן”. צריך לחשוב גם על אינטראקציות בין חלבונים ועל הארגון המרחבי בתוך התא.
סיכום
מיקרואורגניזמים הם פלטפורמה רבת-עוצמה לייצור חומרים - הן מטבוליטים ראשוניים והן שניוניים. העובדה ש-DNA הוא מולקולה אוניברסלית, יחד עם היכולת לקרוא ולכתוב אותו, מאפשרת ביולוגיה סינתטית. פלסמידים משמשים כוקטורים לביטוי חלבונים ותכונות חדשות.
ברפואה, הטכנולוגיה מאפשרת ייצור חיסונים, חלבונים טיפוליים ונוגדנים מונוקלונליים - אם כי ביטוי של חלבונים מורכבים דורש התאמה קפדנית של מערכת הייצור. דוגמת האינסולין ממחישה כיצד פותרים בעיה ביולוגית מורכבת באסטרטגיה הנדסית. דוגמת המתיונין מלמדת שאפשר לשפר מסלולים, להסיר בקרה טבעית ולהנדס יצוא - אך הפער בין הישג מדעי לכדאיות מסחרית נותר אתגר ממשי. ומעל הכול, יש לזכור שתא הוא מערכת מאורגנת וצפופה - ושהצלחה בהנדסה מטבולית תלויה בהבנה של הארגון הפנימי שלו.
דור פסקל