שאלה 1: הפרדת חלבונים לפי נקודה איזואלקטרית
נתון: תמיסה עם שני חלבונים:
- מיוגלובין: $\text{pI} = 7$
- ציטוכרום C: $\text{pI} = 10$
נשאל: כיצד להפריד בין החלבונים ובאיזה $\text{pH}$?
רקע תיאורטי
נקודה איזואלקטרית (pI) היא ה-pH שבו המטען הכולל על החלבון שווה לאפס.
כללי מטען:
- ב-$\text{pH}$ נמוך מה-$\text{pI}$ ← החלבון טעון חיובית (קיבל פרוטונים)
- ב-$\text{pH}$ גבוה מה-$\text{pI}$ ← החלבון טעון שלילית (מסר פרוטונים)
- ב-$\text{pH}$ שווה ל-pI ← מטען כולל = 0
פתרון
כדי להפריד בין שני חלבונים, יש לבחור $\text{pH}$ שבו לאחד מטען חיובי ולשני מטען שלילי.
בחירת $\text{pH}$: נבחר $\text{pH} = 8.5$ (בין 7 ל-10)
במצב זה:
- מיוגלובין ($\text{pI} = 7$): ב-$\text{pH}$ 8.5 > 7, לכן טעון שלילית
- ציטוכרום C ($\text{pI} = 10$): ב-$\text{pH}$ 8.5 < 10, לכן טעון חיובית
שיטת ההפרדה: כרומטוגרפיית חילופי יונים
| סוג עמודה | מה נקשר | מה נשטף |
|---|---|---|
| מחליף קטיונים (טעון שלילית) | ציטוכרום C (+) | מיוגלובין (-) |
| מחליף אניונים (טעון חיובית) | מיוגלובין (-) | ציטוכרום C (+) |
שאלה 2: השפעת ריכוז מלח על מסיסות חלבון
נתון: חלבון נמצא ב-$\text{pH}$ האיזואלקטרי שלו.
נשאל: איך משפיעה הוספת מלח בריכוז נמוך או גבוה על המסיסות?
פתרון - השפעת ריכוז מלח על מסיסות
קיימות שתי תופעות הפוכות:
Salting In (ריכוז מלח נמוך):
- יוני המלח מקיפים את החלבון ויוצרים ״מעטפת״ של מים
- המסיסות עולה
Salting Out (ריכוז מלח גבוה):
- יוני המלח מתחרים עם החלבון על מולקולות המים
- המים ״נגנבים״ מהחלבון
- המסיסות יורדת ← החלבון משקע
הערה לגבי $\text{pI}$: בנקודת ה-$\text{pI}$ המסיסות של חלבון נמוכה יחסית, כי כאשר המטען הכולל = 0, אין דחייה אלקטרוסטטית בין מולקולות החלבון והן נוטות להתקבץ ולשקוע.
שאלה 3: ג׳ל פילטרציה
נשאל:
- כיצד לבחור גרגירי שרף (beads) להפרדת יוני מלח מחלבון?
- כיצד להפריד חלבון במשקל $5,000 \, \mathrm{Da}$ מחלבון במשקל $100,000 \, \mathrm{Da}$?
- להוצאת איזה חלבון נדרש נפח בופר גדול יותר?
רקע תיאורטי - ג׳ל פילטרציה
בג׳ל פילטרציה יש גרגירים (beads) עם נקבוביות בגודל מוגדר:
- מולקולות גדולות מהנקבוביות ← עוברות מסביב לגרגירים ← יוצאות ראשונות
- מולקולות קטנות ← נכנסות לתוך הגרגירים ← מתעכבות ← יוצאות אחרונות
חשוב: זה הפוך מהאינטואיציה! הגדול יוצא ראשון.
פתרון - ג׳ל פילטרציה
1. הפרדת מלח מחלבון:
- יש לבחור beads עם נקבוביות קטנות מספיק כדי שהמלח ייכנס אליהן
- החלבון (גדול) יצא ראשון, המלח (קטן) יצא אחרון
2. הפרדת חלבון $5,000 \, \mathrm{Da}$ מחלבון $100,000 \, \mathrm{Da}$:
- יש לבחור beads עם טווח הפרדה מתאים (למשל $10,000-150,000 \, \mathrm{Da}$)
- החלבון הגדול ($100,000 \, \mathrm{Da}$) יצא ראשון
- החלבון הקטן ($5,000 \, \mathrm{Da}$) יצא אחרון
3. נפח בופר: נדרש נפח בופר גדול יותר להוצאת החלבון הקטן, כי הוא מתעכב יותר בעמודה.
שאלה 4: דיאליזה להפרדת חלבונים
נשאל: האם ניתן להשתמש בדיאליזה להפרדת חלבונים שונים?
רקע תיאורטי - דיאליזה
דיאליזה היא שיטה להחלפת בופר או להסרת מולקולות קטנות:
- שקית הדיאליזה מכילה ממברנה עם נקבוביות
- מולקולות קטנות (מלחים, בופר) עוברות דרך הממברנה
- חלבונים (גדולים) נשארים בתוך השקית
פתרון - שימוש בדיאליזה להפרדת חלבונים
לא מומלץ להשתמש בדיאליזה להפרדת חלבונים שונים.
סיבות:
- הממברנה לא מספיק סלקטיבית להבחין בין חלבונים בגדלים שונים
- התהליך איטי ולא יעיל
- קיימות שיטות טובות יותר: כרומטוגרפיה, ג׳ל פילטרציה, אלקטרופורזה
שימושים מתאימים לדיאליזה:
- החלפת בופר
- הסרת מלחים
- הסרת מולקולות קטנות (כמו חומר מחזר)
שאלה 5: SDS-PAGE וזיהוי מבנה חלבון
נתון:
- משקל מולקולרי בג׳ל פילטרציה: $44,000 \, \mathrm{Da}$
- משקל מולקולרי ב-SDS-PAGE עם $\text{β-mercaptoethanol}$: $22,000 \, \mathrm{Da}$ (בנד אחד)
נשאל:
- מכמה שרשראות פוליפפטידיות מורכב החלבון?
- האם ניתן לקבוע שיש קשרי דיסולפיד?
פתרון - זיהוי מבנה חלבון
1. מספר תת-יחידות:
\[\frac{44,000}{22,000} = 2\]החלבון הוא דימר - מורכב משתי תת-יחידות זהות.
2. לגבי קשרי דיסולפיד:
לא ניתן לקבוע מהנתונים הנוכחיים האם יש קשרי $\ce{S-S}$ בין התת-יחידות.
הסבר: $\text{β-mercaptoethanol}$ מפרק קשרי דיסולפיד, אבל SDS גם מפרק אינטראקציות לא-קוולנטיות (מבנה רבעוני).
ניסוי נדרש: להריץ SDS-PAGE ללא $\text{β-mercaptoethanol}$:
- אם מתקבל בנד של $44,000 \, \mathrm{Da}$ ← יש קשרי $\ce{S-S}$ בין התת-יחידות
- אם מתקבל בנד של $22,000 \, \mathrm{Da}$ ← אין קשרי $\ce{S-S}$ (המבנה הרבעוני התפרק מה-SDS בלבד)
שאלה 6: חישוב מטענים על פפטיד
נתון: הפפטיד $\text{Cys-His-Trp-Glu-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly}$
נשאל: מהו המטען ב-$\text{pH}$ = 1, $\text{pH} = 7$, ו-$\text{pH} = 10.28$?
ערכי pKa רלוונטיים
| קבוצה | pKa |
|---|---|
| קצה קרבוקסילי (C-terminus) | $\sim 2$ |
| קצה אמיני (N-terminus) | $\sim 9$ |
| Glu (שרשרת צד) | $\sim 4$ |
| His (שרשרת צד) | $\sim 6$ |
| Cys (שרשרת צד) | $\sim 8$ |
| Arg (שרשרת צד) | $\sim 12.5$ |
פתרון - חישוב מטענים
ב-$\text{pH} = 1$ (כל הקבוצות מקבלות פרוטון):
| group | state | charge |
|---|---|---|
| N-terminus | $\text{-NH}_3^+$ | +1 |
| C-terminus | $\text{-COOH}$ | 0 |
| Cys | $\text{-SH}$ | 0 |
| His | protonation | +1 |
| Glu | $\text{-COOH}$ | 0 |
| Arg | $\text{-NH}_2^+$ | +1 |
| total | +3 |
ב-$\text{pH} = 7$:
| group | state | charge |
|---|---|---|
| N-terminus | $\text{-NH}_3^+$ (pH < pKa~9) | +1 |
| C-terminus | $\text{-COO}^-$ (pH > pKa~2) | -1 |
| Cys | $\text{-SH}$ (pH < pKa~8) | 0 |
| His | deprotonation (pH > pKa~6) | 0 |
| Glu | $\text{-COO}^-$ (pH > pKa~4) | -1 |
| Arg | $\text{-NH}_2^+$ (pH < pKa~12.5) | +1 |
| total | 0 |
ב-$\text{pH} = 10.28$:
| group | state | charge |
|---|---|---|
| N-terminus | $\text{-NH}_2$ (pH > pKa~9) | 0.5 |
| C-terminus | $\text{-COO}^-$ | -1 |
| Cys | $\text{-S}^-$ (pH > pKa~8) | -1 |
| His | deprotonation | 0 |
| Glu | $\text{-COO}^-$ | -1 |
| Arg | $\text{-NH}_2^+$ (pH < pKa~12.5) | +1 |
| total | -1.5 |
שאלה 7: כיוון נדידה באלקטרופורזה
נתון: שני פפטידים ב-$\text{pH} = 6.5$:
- $\text{Lys-Gly-Ala-Gly}$
- $\text{Glu-Gly-Ala-Glu}$
נשאל:
- לאיזה כיוון ינדדו ללא SDS?
- לאיזה כיוון ינדדו בנוכחות SDS?
פתרון - מציאה מטענים
חישוב מטען ב-$\text{pH} = 6.5$:
פפטיד 1: $\text{Lys-Gly-Ala-Gly}$
| קבוצה | מטען |
|---|---|
| N-terminus | +1 |
| C-terminus | -1 |
| Lys (pKa~10.5) | +1 |
| סה”כ | +1 |
פפטיד 2: $\text{Glu-Gly-Ala-Glu}$
| קבוצה | מטען |
|---|---|
| N-terminus | +1 |
| C-terminus | -1 |
| Glu × 2 (pKa~4) | -2 |
| סה”כ | -2 |
כיוון נדידה ללא SDS:
| פפטיד | מטען | כיוון נדידה |
|---|---|---|
| Lys-Gly-Ala-Gly | +1 | קתודה (אלקטרודה שלילית) |
| Glu-Gly-Ala-Glu | -2 | אנודה (אלקטרודה חיובית) |
כיוון נדידה עם SDS:
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) מצפה את כל החלבונים במטען שלילי אחיד.
לכן, שני הפפטידים ינדדו לכיוון האנודה (+), וההפרדה תהיה לפי גודל בלבד (לא לפי מטען).
שאלה 8: קינטיקה של מיכאליס-מנטן
נתון: תוצאות ניסוי קינטי:
| [S] mM | $V_0$ (mmol/min) |
|---|---|
| 0 | 0 |
| 1 | 3 |
| 2 | 5 |
| 4 | 6.5 |
| 8 | 7 |
| 12 | 6.2 |
נשאל: האם האנזים מתנהג לפי מיכאליס-מנטן?
רקע תיאורטי - מיכאליס-מנטן
משוואת מיכאליס-מנטן:
\[V_0 = \frac{V_{\text{max}} \cdot [S]}{K_{\text{m}} + [S]}\]התנהגות צפויה: $V_0$ עולה עם עליית $[S]$ ומתקרבת אסימפטוטית ל-$V_{\text{max}}$.
פתרון - ניתוח הנתונים
האנזים אינו מתנהג לפי מיכאליס-מנטן.
הסיבה: בריכוזי סובסטרט גבוהים $(12 \, \mathrm{mM})$ יש ירידה בפעילות האנזים (מ-7 ל-6.2), במקום התייצבות.
הסבר: תופעה זו נקראת עיכוב על ידי סובסטרט (Substrate Inhibition):
- בריכוזי סובסטרט גבוהים מאוד, מולקולות סובסטרט נוספות נקשרות לאנזים באופן לא-פרודוקטיבי
- זה מעכב את פעילות האנזים
- תופעה זו משמשת כאסטרטגיית בקרה בחלק מהאנזימים
גרף אופייני:
V₀ ↑
| ___
| / \
| / \___
| /
| /
|/________________← [S]
סיכום עקרונות מרכזיים
| נושא | עיקרון |
|---|---|
| pI ומטען | $\text{pH} < \text{pI}$ ← מטען (+) $\text{pH} > \text{pI}$ ← מטען (-) |
| הפרדה בחילופי יונים | בחר pH שבו לחלבונים מטענים הפוכים |
| ג׳ל פילטרציה | הגדול יוצא ראשון (הפוך מהאינטואיציה) |
| SDS-PAGE | הפרדה לפי גודל בלבד (SDS מבטל הבדלי מטען) |
| זיהוי קשרי $\ce{S-S}$ | נדרש ניסוי השוואתי עם ובלי חומר מחזר |
| מיכאליס-מנטן | סטייה מהמודל עשויה להעיד על עיכוב ע״י סובסטרט |