שיעור 16 שעתוק בחיידקים

תוכן העניינים:

1. פתיחה - משכפול לשעתוק
2. DNA לעומת RNA
3. עקרון השעתוק
4. RNA polymerase
5. שעתוק בחיידקים
6. Termination בחיידקים
7. אופרונים בחיידקים
8. כיווניות גנים על גבי ה־DNA
9. אנטיביוטיקות שפוגעות בשעתוק חיידקי

פתיחה - משכפול לשעתוק

בשיעורים הקודמים עסקנו בעיקר בשכפול DNA וביציבות הגנום. שכפול מתרחש בשלב S phase של מחזור התא, ובו מולקולת DNA דו־גדילית משוכפלת למולקולת DNA נוספת.

מכאן עוברים לתהליך אחר: יצירת RNA מתוך DNA.

הזרימה הכללית היא:

DNA → RNA → Protein

• Transcription - שעתוק DNA ל־RNA.
• Translation - תרגום RNA לחלבון.

עיקר השעתוק והתרגום בתא מתרחש ב־G1, אבל שעתוק ותרגום יכולים להתרחש גם בשלבים אחרים של מחזור התא. לדוגמה, בשלב S יש סינתזה של היסטונים, וב־G2 יש שעתוק של פקטורים הקשורים לבקרת מחזור התא.

בהמשך החלק הזה של הקורס נעסוק בשעתוק בחיידקים, שעתוק בתאים אאוקריוטיים, עיבוד RNA, תרגום, רגולציה של ביטוי גנים, ולבסוף גם סוגי RNA שאינם מקודדים לחלבון.

DNA לעומת RNA

לפני שנכנסים לשעתוק, צריך להיזכר בהבדלים בין DNA ל־RNA.

הסוכר

ב־DNA הסוכר הוא deoxyribose. הוא נקרא כך משום שבעמדה 2’ חסרה קבוצת OH.

ב־RNA הסוכר הוא ribose, ויש בו קבוצת OH בעמדה 2’. ההבדל הזה משפיע על יציבות המולקולה ועל התכונות הכימיות שלה.

הבסיסים

ב־DNA יש:

A, T, C, G

ב־RNA יש:

A, U, C, G

כלומר, במקום T יש U.

הסיבה שהוזכרה בשיעור היא ש־RNA צריך להיות פחות יציב ויותר ניתן לבקרה. הבסיס U פחות יציב מ־T ויכול לעבור מודיפיקציות שונות.

מבנה חד־גדילי

RNA הוא בדרך כלל חד־גדילי, ולכן הוא יכול להתקפל וליצור מבנים מרחביים שונים. המבנים האלה יכולים להשפיע על יציבות ה־RNA, על פירוקו ועל תפקודו.

עקרון השעתוק

בתהליך השעתוק, RNA polymerase נקשר ל־DNA, פותח את שני הגדילים, ומשתמש באחד מהם כתבנית ליצירת RNA חדש.

הגדיל שממנו נוצר ה־RNA נקרא:

• template strand
• או antisense strand

הגדיל השני נקרא:

• coding strand
• או sense strand

ה־RNA החדש נבנה תמיד בכיוון:

5' → 3'

Template strand ו־coding strand

ה־RNA שנוצר משלים ל־template strand, ודומה מאוד ל־coding strand.

ההבדל המרכזי הוא שב־RNA יש U במקום T.

לדוגמה, אם ה־coding strand מכיל רצף עם T, ב־RNA המקביל יופיע U.

Coding strand:  5' ... A T G C ... 3'
RNA:            5' ... A U G C ... 3'

כלומר, כדי לעבור מ־coding strand ל־RNA, מחליפים T ב־U.

לעומת זאת, אם עובדים מול template strand, צריך לבנות רצף משלים:

DNA template A → RNA U
DNA template T → RNA A
DNA template C → RNA G
DNA template G → RNA C

RNA polymerase

RNA polymerase הוא האנזים שמסנתז RNA מתוך תבנית DNA.

הוא יוצר קשרים פוספודיאסטריים בין נוקלאוטידים, כך שה־RNA מתארך תמיד בכיוון 5’ ל־3’.

איך נוצר הקשר?

באתר הקטליטי של RNA polymerase יש חומצות אמינו מסוג אספרטט ושני יוני מגנזיום. האתר הקטליטי מאפשר חיבור של הנוקלאוטיד הבא לשרשרת ה־RNA המתארכת.

האנרגיה לתהליך מגיעה מפירוק הפוספטים של הנוקלאוטיד הנכנס. כך נוצר קשר פוספודיאסטרי בין הנוקלאוטיד הקיים בשרשרת לבין הנוקלאוטיד החדש.

RNA polymerase בחיידקים לעומת יונקים

בחיידקים יש RNA polymerase אחד שיודע לייצר את כל סוגי ה־RNA:

• mRNA
• rRNA
• tRNA
• RNA קטנים ורגולטוריים

בתאים אאוקריוטיים יש כמה RNA polymerases עיקריים:

בשיעור הזה ההתמקדות היא בשעתוק בחיידקים.

שלבי השעתוק

בכל מערכות השעתוק יש שלושה שלבים כלליים:

1. Initiation - התחלת השעתוק.
2. Elongation - הארכת ה־RNA.
3. Termination - סיום השעתוק.

בחיידקים התהליך פשוט יותר מאשר בתאים אאוקריוטיים, משום שאין הפרדה בין גרעין לציטוזול. לכן RNA יכול להתחיל לעבור תרגום כמעט מיד לאחר שהוא נוצר.

שעתוק בחיידקים

בחיידקים, RNA polymerase מורכב מ־core enzyme ומיחידת עזר שנקראת sigma factor.

Core enzyme ו־holoenzyme

ה־core enzyme מורכב מכמה תת־יחידות:

• שתי תת־יחידות α
• תת־יחידה β
• תת־יחידה β’
• תת־יחידה ω

כאשר מצטרף אליו sigma factor, מתקבל:

holoenzyme

ה־core enzyme דומה בין גנים שונים. הספציפיות לזיהוי פרומוטורים מגיעה בעיקר מה־sigma factor.

כלומר, sigma factor עוזר ל־RNA polymerase לדעת איפה להתחיל שעתוק.

Initiation

בשלב ההתחלה, ה־holoenzyme נקשר ל־DNA ומחפש אזור פרומוטור.

הפרומוטור נמצא לפני תחילת הגן, כלומר upstream ביחס לנקודת ההתחלה של השעתוק.

אם תחילת השעתוק מוגדרת כעמדה:

+1

אז רצפים בפרומוטור נמצאים בעמדות שליליות, למשל:

-10
-35

Pribnow box

הפרומוטור החיידקי הקלאסי שנלמד הוא Pribnow box.

יש בו שני אזורים חשובים:

• אזור סביב -10
• אזור סביב -35

ה־sigma factor מזהה את הרצפים האלה ומביא לשם את RNA polymerase.

האזור סביב -10 עשיר בדרך כלל ב־A ו־T. זה חשוב כי זוגות A-T מוחזקים על ידי שני קשרי מימן בלבד, לעומת C-G שמוחזקים על ידי שלושה קשרי מימן. לכן קל יותר לפתוח את הגדילים באזור עשיר ב־A/T.

זה מזכיר רעיונית את TATA box באאוקריוטים, שגם הוא אזור עשיר ב־A/T.

חוזק הפרומוטור

רצף הפרומוטור יכול להשתנות מעט. השינויים האלה משפיעים על חוזק הקישור של sigma factor ושל RNA polymerase.

פרומוטור “חזק” יוביל בדרך כלל לשעתוק יעיל יותר, ופרומוטור חלש יוביל לפחות שעתוק.

Scrunching mechanism

לאחר הקישור לפרומוטור, RNA polymerase עדיין לא נכנס מיד ל־elongation.

הוא פותח את ה־DNA ומתחיל לייצר כמה נוקלאוטידים ראשונים של RNA, אבל עדיין מוחזק באזור הפרומוטור דרך sigma factor.

בשלב הזה מתרחש מנגנון שנקרא scrunching: הפולימראז מושך DNA לתוכו, מתחיל לסנתז RNA קצר, אבל עדיין לא מצליח לברוח מהפרומוטור.

אפשר לחשוב על זה כמו מכונית שמחזיקה ברקס ולוחצת על גז. מצטברת אנרגיה, אבל התנועה קדימה עדיין מוגבלת.

כאשר RNA polymerase מצליח לייצר RNA באורך של בערך יותר מ־10 נוקלאוטידים, הוא משתחרר מהפרומוטור. בשלב הזה sigma factor משתחרר, והפולימראז נכנס ל־elongation.

Elongation

בשלב elongation, RNA polymerase מתקדם לאורך הגן ומסנתז RNA חדש על בסיס template strand.

התהליך ממשיך באותו עיקרון:

• ה־DNA נפתח מקומית.
• RNA polymerase קורא את ה־template strand.
• נוקלאוטידים מתווספים ל־RNA בכיוון 5’ ל־3’.
• מאחורי הפולימראז ה־DNA חוזר להיסגר.

ה־RNA ממשיך להתארך עד שהפולימראז מגיע לאזור סיום השעתוק.

Termination בחיידקים

בחיידקים יש שתי דרכים עיקריות לסיים שעתוק:

1. Rho-independent termination
2. Rho-dependent termination

Rho-independent termination

זה נקרא גם intrinsic termination, כי הוא אינו דורש חלבון Rho.

במצב כזה, לקראת סוף הגן יש רצפים שיוצרים ב־RNA מבנה של hairpin.

על גבי ה־DNA יש אזורים שמובילים ליצירת רצפים משלימים ב־RNA, כך שה־RNA החדש יכול להתקפל על עצמו וליצור hairpin. מיד אחר כך יש אזור שמוביל ליצירת רצף עשיר ב־U ב־RNA.

השילוב בין שני דברים גורם לסיום השעתוק:

• מבנה hairpin שיוצר הפרעה מבנית.
• רצף U שמחזיק חלש יחסית מול A בתבנית ה־DNA.

הקשר החלש באזור ה־U, יחד עם המבנה שנוצר ב־RNA, גורם לשחרור ה־RNA ולניתוק RNA polymerase מה־DNA.

Rho-dependent termination

במסלול הזה יש חלבון בשם Rho.

על ה־RNA החדש נוצר רצף שנקרא:

Rho utilization site - rut

Rho מזהה את הרצף הזה, נקשר ל־RNA ומתחיל לנוע עליו לכיוון RNA polymerase.

בשלב מסוים RNA polymerase מאט, למשל בגלל מבנה קטן שנוצר ב־RNA. ההאטה מאפשרת ל־Rho להשיג אותו.

כאשר Rho מגיע לקומפלקס השעתוק, הוא מפריד את ה־RNA מה־DNA ומפרק את הקומפלקס. כך השעתוק מסתיים.

לאחר termination, RNA polymerase משתחרר מה־DNA ויכול להתחבר שוב ל־sigma factor ולהתחיל מחזור שעתוק חדש.

אופרונים בחיידקים

לחיידקים יש גנום קטן יחסית, ולכן יש להם ארגון יעיל של גנים.

אחת הצורות החשובות לארגון כזה היא operon.

Operon הוא אזור גנטי שבו כמה גנים שקשורים לאותו תהליך נשלטים יחד ומופיעים על אותו mRNA.

מבנה כללי של operon

אופרון כולל בדרך כלל:

• Promoter - אזור שאליו נקשר RNA polymerase.
• Operator - אזור רגולטורי שאליו נקשרים חלבוני בקרה.
• כמה גנים שקשורים לאותו תהליך.
• גן רגולטורי שמקודד לחלבון שמבקר את האופרון.

בחיידקים, mRNA אחד יכול לקודד לכמה חלבונים שונים. זה נקרא mRNA פוליציסטרוני.

Inducible operon - lac operon

Lac operon הוא דוגמה לאופרון אינדוסיבילי.

הוא מאפשר לחיידק להשתמש בלקטוז כמקור אנרגיה, אבל אין סיבה לייצר את החלבונים האלה אם אין לקטוז בסביבה.

כשאין לקטוז

הגן הרגולטורי מייצר repressor.

ה־repressor נקשר ל־operator ומונע מ־RNA polymerase לשעתק את גני lac operon.

כלומר, בהיעדר לקטוז, האופרון כבוי.

כשיש לקטוז

חלק מהלקטוז הופך ל־allolactose.

Allolactose נקשר ל־repressor ומשנה את הקונפורמציה שלו. בעקבות שינוי המבנה, ה־repressor כבר לא יכול להיקשר ל־operator.

כאשר ה־repressor משתחרר, RNA polymerase יכול לשעתק את גני האופרון, ובסוף נוצרים חלבונים שמאפשרים פירוק וניצול של לקטוז.

Repressible operon - trp operon

Trp operon הוא דוגמה לאופרון רפרסיבילי.

האופרון הזה אחראי לסינתזה של tryptophan.

כשאין טריפטופן

כאשר אין טריפטופן בסביבה, החיידק צריך לייצר אותו בעצמו. לכן האופרון פעיל, והגנים שמאפשרים סינתזה של טריפטופן משועתקים.

כשיש טריפטופן

כאשר יש טריפטופן בסביבה, אין לחיידק סיבה להשקיע אנרגיה בייצור עצמי שלו.

טריפטופן נקשר ל־repressor ומשנה את הקונפורמציה שלו. עכשיו ה־repressor יכול להיקשר ל־operator ולחסום את RNA polymerase.

כך השעתוק של הגנים לסינתזת טריפטופן נעצר או יורד.

ההיגיון הפוך:

• ב־lac operon, נוכחות הסוכר מפעילה את המסלול שנועד לפרק אותו.
• ב־trp operon, נוכחות התוצר מכבה את המסלול שנועד לייצר אותו.

כיווניות גנים על גבי ה־DNA

לא כל הגנים בגנום נמצאים על אותו גדיל ובאותו כיוון.

על אותו מקטע DNA יכולים להיות:

• גנים בכיוון אחד.
• גנים בכיוון ההפוך.
• גנים חופפים.
• גנים סמוכים מאוד.

מה שקובע איזה גדיל ישמש כ־template הוא הפרומוטור וכיוון השעתוק שהוא מגדיר.

לכן template strand ו־coding strand אינם תכונה קבועה של גדיל מסוים. הם מוגדרים ביחס לגן מסוים.

עבור גן אחד, גדיל מסוים יכול להיות template. עבור גן אחר באותו אזור, הגדיל השני יכול להיות template.

אנטיביוטיקות שפוגעות בשעתוק חיידקי

בסוף השיעור חיברנו את מנגנון השעתוק לרפואה דרך אנטיביוטיקות שפוגעות בשעתוק חיידקי.

Rifampin

Rifampin נקשר לתת־היחידה β של RNA polymerase החיידקי ומונע את תהליך elongation.

הוא משמש בין השאר בטיפול בשחפת ובזיהומים נוספים.

Fidaxomicin

Fidaxomicin נקשר לאזורים ב־RNA polymerase שקשורים לפתיחת גדילי ה־DNA. כך הוא מונע מהפולימראז לפתוח את ה־DNA ולהתחיל שעתוק תקין.

גם הוא משמש בהקשרים של זיהומים במערכת העיכול.

Actinomycin D

Actinomycin D נקשר ישירות ל־DNA ומפריע פיזית להתקדמות RNA polymerase ולסינתזת RNA.

הוא פחות ספציפי ולכן אינו מתאים כאנטיביוטיקה רגילה לשימוש רחב. יש לו שימושים חשובים במחקר, ובמצבים מסוימים גם באונקולוגיה.

Bicyclomycin

Bicyclomycin פוגע בחלבון Rho.

אם Rho אינו פועל, termination במסלול Rho-dependent נפגע. RNA polymerase ממשיך לסנתז בצורה לא תקינה, והבקרה על סיום השעתוק נפגעת.

הפגיעה הזאת יכולה לפגוע בחיוניות החיידק.