שיעור 4 Cleavage, Blastocyst ותאי גזע עובריים

מתודולוגיות לחקר התפתחות עוברים

עד עכשיו הדיון עסק ב״שפה״ שבה תאים עובריים מתקשרים זה עם זה כדי ליצור בסופו של דבר אורגניזם שלם. מכאן נכנסים לשלבי ההתפתחות העוברית עצמם: Cleavage, בהמשך Gastrulation, ובהמשך הקורס גם Organogenesis, לפי ההתקדמות.

לפני הכניסה ל־Cleavage צריך להגדיר את המתודולוגיות הניסויית המרכזיות שבהן משתמשים כדי להבין תהליכים התפתחותיים.

Loss of Function

Loss of function הוא ניסוי שבו פוגעים בגן מסוים שחושדים שהוא מעורב בתהליך התפתחותי. הפגיעה יכולה להיות מחיקה של הגן, או יצירה של חלבון לא פונקציונלי. המטרה היא לשאול מה קורה כאשר אותו גן או חלבון אינו פעיל.

יש שתי רמות מרכזיות שבהן משתמשים בגישה הזאת:

1. פגיעה במסלול איתות - כאשר רוצים להבין מסלול תקשורת בין תאים, לא תמיד מספיק לפגוע ברצפטור אחד. במסלולים רבים יש redundancy: כמה ליגנדים, כמה רצפטורים או כמה מרכיבים שמסוגלים לפצות זה על זה. לכן מחפשים את צוואר הבקבוק של המסלול, כלומר נקודה מרכזית שאם פוגעים בה באמת חוסמים את המסלול. בדוגמה שניתנה, במסלול Wnt הקנוני יש הרבה ליגנדים ורצפטורים, אבל β-catenin הוא אפקטור מרכזי אחד.

2. פגיעה ב־transcription factor - transcription factors יכולים לשמש כ־master regulators: הם מכתיבים לתא תוכנית התפתחותית שלמה. לכן פגיעה בגן שמקודד ל־transcription factor יכולה לחשוף את תפקידו בתהליך ההתפתחותי.

Gain of Function

Gain of function הוא ניסוי שבו לא מורידים פעילות של גן, אלא מוסיפים או מגבירים אותה. יש שתי צורות עיקריות:

הדוגמה המרכזית הייתה Pax6 בדרוזופילה. בניסוי loss of function, מוטציה ב־Pax6 גורמת לכך שלא נוצרת עין, בעוד שאר הזבוב מתפתח יחסית רגיל. מכאן אפשר להסיק ש־Pax6 חיוני ליצירת עין, אבל לא מעבר לזה.

בניסוי gain of function, כאשר מבטאים Pax6 באזורים שבהם הוא לא אמור להתבטא, למשל ברגל או בגב, נוצרים מבנים דמויי עין באותם מקומות. העיניים האלה אינן פונקציונליות כי הן אינן מחוברות למערכת העצבים, אבל עצם הופעתן מראה ש־Pax6 מסוגל להפעיל תוכנית התפתחותית מורכבת של יצירת עין.

המסקנה המתודולוגית היא ש־gain of function ו־loss of function משלימים זה את זה. Gain of function לבד אינו מספיק כדי להבין משמעות פיזיולוגית, כי צריך לדעת גם מה קורה כאשר הגן חסר.

Cleavage: מושגים בסיסיים

לפני שמתארים את שלב ה־Cleavage צריך לסדר את המושגים הקשורים לתאי המין ולזיגוטה.

• זיגוטה - תא אחד שנוצר מאיחוד של ביצית ותא זרע. זה התא הראשון של העובר.
• Primordial germ cells / PGCs - תאים שנוצרים בתחילת ה־Gastrulation. בשלב הזה עדיין אין איברי מין, ולכן התאים האלה נודדים במהלך ההתפתחות העוברית עד שהם מגיעים לאיברי המין המתפתחים.
• Germ cells / GCs - PGCs שכבר התמקמו באיברי המין. בשלב הזה אין עדיין משמעות לזכר או נקבה מבחינתם; בהמשך, בהתאם לקונטקסט, הם יתמיינו לכיוון יצירת תאי זרע או ביציות.
• Gametes - תאי המין הסופיים: תא זרע או ביצית. הם נוצרים מה־germ cells לאחר תהליך התמיינות וחלוקת הפחתה.
• Somatic cells - תאי הגוף. ההבדל המרכזי שהודגש הוא שתאים סומטיים מבצעים מיטוזה בלבד, בעוד ש־germ cells יכולים לבצע גם מיטוזה וגם מיוזה.

מיוזה ומיטוזה

מיוזה כוללת שתי חלוקות: החלוקה המיוטית הראשונה והחלוקה המיוטית השנייה.

מיוזה I

בחלוקה המיוטית הראשונה, השלב הראשון הוא prophase I. לפני הקונדנסציה מתרחשת רפליקציה של ה־DNA, כך שנוצרות כרומטידות אחיות. לאחר מכן הכרומוזומים ההומולוגיים עוברים pairing זה עם זה.

במעבר ל־metaphase I, הכרומוזומים ההומולוגיים מסתדרים במרכז התא. כל כרומוזום הומולוגי כבר מורכב משתי כרומטידות אחיות, ולכן בשלב הזה יש מצב של 4n מבחינת כמות DNA. לאחר מכן, ב־anaphase I, מתבצעת הפרדה של הכרומוזומים ההומולוגיים. זו חלוקת ההפחתה.

בסוף מיוזה I מתקבלים שני תאים. בכל תא יש אחד מכל זוג כרומוזומים הומולוגיים, אך כל כרומוזום עדיין מורכב משתי כרומטידות אחיות.

מיוזה II

במיוזה II מתרחש תהליך דומה מבחינה מבנית: הכרומוזומים עוברים קונדנסציה, מסתדרים במרכז התא, ואז מתבצעת הפרדה של הכרומטידות האחיות. בסוף התהליך מתקבלים ארבעה תאים שעברו חלוקת הפחתה ויכולים להתמיין לגמטות.

בזכרים, מכל germ cell אחד מתקבלים בסוף ארבעה תאי זרע. התהליך הזה מתרחש בבגרות המינית.

מיוזה בנקבות

בנקבות התהליך מורכב יותר. ה־PGCs נודדים עד שנוצרות השחלות, נכנסים אליהן, ולפני הלידה עוברים פרוליפרציה מיטוטית משמעותית. חלק גדול מהתאים עובר מוות תאי, ונשארת אוכלוסייה של תאי מין.

לאחר מכן התאים נכנסים לחלוקה המיוטית הראשונה, כלומר מתחילים התמיינות לכיוון ביציות. כאשר אומרים שנקבות נולדות עם כל הביציות שלהן, הכוונה היא שהתאים האלה נכנסו ל־prophase I ונעצרו שם.

במהלך prophase I מתרחש pairing של כרומוזומים הומולוגיים, נוצר synaptonemal complex, מתרחש crossing over ונוצרות chiasmata. העצירה בנקבות מתרחשת בשלב diplotene, ממש לפני לידת העוברית.

Primary Oocyte, Zona Pellucida ו־GVBD

Oocyte היא ביצית. ב־primary Oocyte רואים תא גדול ובמרכזו גרעין, שנקרא בהקשר הזה germinal vesicle.

מסביב ל־Oocyte נמצאת Zona Pellucida (ZP). לפי השיעור, היא מורכבת משלושה חלבונים: ZP1, ZP2 ו־ZP3, ויוצרת מעטפת קשיחה מאוד סביב הביצית. ה־Zona Pellucida חיונית להפריה, בין היתר משום שתא הזרע מזהה אותה.

השלב הבא הוא GVBD - Germinal Vesicle Breakdown. המשמעות היא פירוק הגרעין. פירוק הגרעין מאפשר לביצית להמשיך בתהליך המיוזה, לייצר כישור ולהתקדם לכיוון metaphase.

Oocyte Meiotic Maturation

בבגרות המינית, בהשפעת LH - Luteinizing Hormone, ה־primary oocyte יוצאת מהעצירה וממשיכה במיוזה. בתהליך הזה מתרחש אירוע ייחודי לביציות: Symmetry Breaking. הכישור נע אל הפריפריה של התא, קרוב לממברנה, ולכן החלוקה אינה סימטרית.

לאחר החלוקה המיוטית הראשונה מתקבלים שני תאים לא שווים:

• תא גדול שנשאר הביצית.
• first polar body, שמכיל סט כרומוזומים קטן ונעלם בהמשך.

הסט שנשאר בביצית נשאר צמוד לממברנה, נוצר שוב כישור, והביצית נעצרת ב־metaphase II. מי שמוציא את הביצית מהעצירה השנייה הוא תא הזרע. לאחר כניסת תא הזרע מתרחשת השלמת החלוקה, נוצר second polar body, והכרומוזומים של הביצית ושל תא הזרע מתארגנים בגרעינים. לאחר fusion של שני הגרעינים מתקבלת הזיגוטה.

בסך הכול הודגשו שתי עצירות:

1. עצירה לפני הלידה, ב־prophase I.
2. עצירה בזמן הביוץ, ב־metaphase II.

במהלך התפתחות ה־Oocyte, הביצית גדלה מאוד וצוברת כמויות גדולות של RNA. ה־RNA הזה חשוב להמשך, משום שבתחילת ההתפתחות העוברית הגנום של העובר עדיין אינו פעיל.

מההפריה ועד אחרי שלב שני התאים, העובר תלוי ב־RNA אימהי שהביצית הביאה. רק אחרי שלב שני התאים מתחילה אקטיבציה של הגנום העוברי ומתחיל שעתוק עוברי.

Cleavage והיווצרות ה־Blastocyst

ה־Zona Pellucida היא מעטפת קשיחה ולא מתיחה. לכן כל החלוקות הראשונות מתרחשות בתוך אותו נפח מוגבל, והתאים נעשים קטנים יותר ויותר.

הסדר הכללי:

1. Zygote - תא אחד.
2. חלוקה ראשונה לשני תאים.
3. חלוקה לארבעה תאים.
4. חלוקה לשמונה תאים.
5. מעבר ל־16 תאים - שלב ה־morula.
6. התחלת cavitation - מעבר ל־early blastocyst.
7. blastocyst מתקדם יותר, שבו מבחינים ב־ICM וב־trophectoderm.

כל תא בשלבים הראשונים נקרא blastomere.

First cell fate decision

שלב ה־morula קשור ל־first cell fate decision. עד שלב שמונת התאים, כל blastomere רואה סביבה דומה: מצד אחד Zona Pellucida ומהצדדים האחרים Blastomeres נוספים.

ב־morula נוצרת הבחנה בין:

זו נקודה מרכזית משום שמתחילה לראשונה הבחנה בין תאים שנמצאים בחוץ לבין תאים שנמצאים בפנים.

Cavitation ו־Blastocyst

בשלב מסוים מתחיל להיווצר חלל בתוך העובר. התהליך נקרא Cavitation, והחלל נקרא Blastocoel. ברגע שמופיע חלל ראשוני, העובר נקרא Early Blastocyst.

בהמשך ה־Blastocoel גדל, ונוצר Blastocyst שבו ניתן להבחין בשתי אוכלוסיות:

• Trophoblast cells / trophectoderm - תאי המעטפת. יוצרים רקמות חוץ־עובריות, כמו שליה ורקמות חוץ־עובריות נוספות.
• Inner cell mass / ICM - קבוצת תאים פנימית בצד אחד של ה־Blastocyst. ממנה יתפתח העובר עצמו.

יצירת ה־Blastocyst היא נקודה בלתי הפיכה מבחינה התפתחותית. בהמשך ה־blastocyst צריך לצאת מה־Zona Pellucida; הדבר נעשה באמצעות הפרשת פרוטאזות באזור מסוים, פירוק של ה־Zona Pellucida ויציאה החוצה. לאחר מכן ה־Blastocyst יכול לעבור השרשה ברחם.

Compaction

Compaction הוא שלב שבו התאים עוברים דחיסה. מספר התאים לא בהכרח משתנה ברגע הזה, אבל המורפולוגיה משתנה. זה חלק מהמעבר למבנה שבו מתחילים להבחין בין תאים חיצוניים לתאים פנימיים.

Totipotency, Pluripotency והתמיינות

בשלבים המוקדמים, הזיגוטה וה־Blastomeres הם Totipotent: יש להם יכולת לתת את כל העובר וגם רקמות חוץ־עובריות.

מתחת לכך נמצאת Pluripotency: יכולת לתת הרבה סוגי רקמות עובריות, אך לא את כל הרקמות החוץ־עובריות.

הסדר שהוצג הוא:

1. Totipotent
2. Pluripotent
3. Oligopotent
4. Unipotent
5. Terminal differentiation

ההבחנה שהודגשה בהמשך היא שייתכן ש־Totipotency אינה עולם נפרד לגמרי מ־Pluripotency, אלא Pluripotency בתוספת רכיבים נוספים. לפי המודל שהוצג, מעבר מ־Totipotency ל־Pluripotency יכול להיתפס כאיבוד של אותם רכיבים נוספים.

Stem cells: maintenance, expansion ואובדן אוכלוסיית תאי הגזע

תאי גזע חייבים להיות מסוגלים לבצע self-renewal ולתת לפחות lineage אחד של תאים ממוינים.

Maintenance

ב־maintenance, אוכלוסיית תאי הגזע נשמרת. כלומר, מתחילים עם מספר מסוים של stem cells ומסיימים עם מספר דומה, אף שבמהלך הדרך תאים התחלקו וחלק מהתאים נתנו תאים committed שימשיכו להתמיינות.

Expansion

ב־expansion, המטרה היא להגדיל את אוכלוסיית תאי הגזע. תא גזע עובר self-renewal ונותן שני תאי גזע, וכך האוכלוסייה גדלה. בהמשך חלק מהתאים יכולים להתחיל התמיינות.

אובדן stem cells

תאי גזע אינם בהכרח ״חיים לנצח״. בהקשרים מסוימים אוכלוסיית תאי הגזע יכולה להיעלם, למשל אם חלוקות מובילות לכך שהתאים מפסיקים להיות stem cells והופכים לתאים committed.

Embryonic stem cells / ES cells

Embryonic stem cells הם תאים שמקורם ב־ICM של ה־blastocyst. באופן מלאכותי, אפשר לקחת blastocyst, לפתוח אותו, להוציא את ה־ICM ולגדל את התאים בתרבית, בתנאים שמאפשרים להם להישמר וליצור מושבות.

לתאים האלה יש תכונות של pluripotent cells, משום שהמקור שלהם הוא ICM, וה־ICM נותן את תאי העובר.

איך מוכיחים pluripotency?

הדרך הניסויית שתוארה משתמשת ב־GFP - Green Fluorescent Protein. מכניסים לתאי ES יכולת לבטא GFP, כך שהם זוהרים בירוק. לאחר מכן מזריקים את תאי ה־ES אל תוך ה־blastocoel של blastocyst אחר.

חלק מהתאים ימותו וחלק יעברו incorporation אל תוך ה־ICM. אם הם אכן משתלבים ב־ICM, הם יכולים לתרום לרקמות שונות בעובר. לאחר החזרת ה־blastocyst לנקבה והתפתחות העובר, מתקבל עובר כימרי.

כימרה בהקשר הזה היא עובר שמורכב משתי אוכלוסיות תאים בעלות מקור גנטי שונה. אם רואים תאים זוהרים ברקמות שונות של העובר, זו הוכחה לכך שתאי ה־ES תרמו לסוגי תאים שונים בעובר ולכן הם pluripotent.

עם זאת, תאי ES לבדם אינם יוצרים blastocyst. צריך להזריק אותם לתוך blastocyst קיים כדי שיוכלו להשתלב ב־ICM.

First ו־Second Cell Fate Decision

First cell fate decision

כאמור, ה־first cell fate decision הוא המעבר שבו מבחינים בין inner cells לבין outer cells. ה־inner cells יובילו ל־ICM, וה־outer cells יובילו ל־trophectoderm.

Second cell fate decision

לאחר יצירת ה־ICM מתרחש אירוע נוסף: second cell fate decision. ה־ICM עצמו עובר התמיינות לשני סוגי תאים:

תשומת הלב שעדיין אין כאן germ layers; זה לא שלב הגסטרולציה.

כל התהליך שתואר עד blastocyst יכול להתרחש in vitro, כלומר בצלחת, ללא רחם וללא השרשה. זה חשוב ניסויית כי אפשר לעקוב אחרי ההתפתחות תחת מיקרוסקופ.

הציר embryonic / abembryonic

ב־blastocyst מופיע לראשונה ציר מרחבי: בצד אחד נמצא ה־ICM, שייתן את העובר, ובצד השני אזור ללא ICM. זהו ציר embryonic-abembryonic.

שינויים אחרי השרשה

סביב ההשרשה, המבנה המרחבי משתנה. הרקמות שתוארו קודם ממשיכות להתקיים, אבל מסודרות אחרת:

• ה־epiblast, שהיה כדור תאים, מקבל צורה דמויית cup.
• תאי trophectoderm מתחלקים מאוד ויוצרים extraembryonic ectoderm.
• למעלה נמצא ectoplacental cone, שיתרום לשליה.
• ה־primitive endoderm מקיף את ה־epiblast ואת ה־extraembryonic ectoderm.

ה־primitive endoderm נותן שתי אוכלוסיות:

המאפיין שהודגש לגבי parietal endoderm הוא יכולת הנדידה שלו.

ניסוי: מורולה לעומת early blastocyst

בניסוי נלקחו שני עוברים:

1. עובר של 16 תאים - morula.
2. עובר של 32 תאים - early blastocyst, משום שכבר יש התחלת cavitation ו־blastocoel.

שני העוברים הוכנסו לצבען פלואורסצנטי ירוק שנקשר לממברנות. רק התאים החיצוניים נצבעו, כי רק הם חשופים לצבען. לאחר מכן פירקו את העוברים לתאים בודדים:

• תאים ירוקים = outer cells.
• תאים לא צבועים = inner cells.

ניסוי ביקורת

כאשר לוקחים את כל התאים יחד, ירוקים ולא ירוקים, ומרכיבים אותם מחדש כאגרגט, מתקבל blastocyst תקין. מכאן שהמניפולציה עצמה לא הרסה את העובר, ושבשלבים האלה התאים עדיין יכולים לתרום להתפתחות.

16-cell embryo

בעובר של 16 תאים, כאשר מרכיבים אגרגט רק מ־inner cells או רק מ־outer cells, בשני המקרים מתקבלים blastocysts. כלומר, בשלב ה־morula, גם inner cells וגם outer cells עדיין אינם committed. הם עדיין יכולים לתת גם ICM וגם trophectoderm.

עם זאת, יש הבדל בתזמון: האגרגט של ה־outer cells מתקדם מהר יותר ליצירת blastocyst לעומת האגרגט של ה־inner cells. לפי השיעור, אין הסבר ברור להבדל הזה, אבל הוא מראה שהתאים אינם זהים לגמרי למרות שהם עדיין לא מחויבים.

32-cell embryo

בשלב של 32 תאים, מתקבלת תמונה שונה:

• אגרגט של inner cells יכול ליצור morula ובהמשך blastocyst עם blastocoel, ICM ו־trophectoderm.
• אגרגט של outer cells יוצר מבנה עם blastocoel ו־trophectoderm, אבל ללא ICM.

המסקנה היא שבשלב הזה ה־outer cells כבר עברו commitment לכיוון trophectoderm, ואינם יכולים ליצור ICM. זו המשמעות של ה־irreversible step שהוזכר קודם.

Cell Fate Decision ברמה המולקולרית

כדי להבין את ה־first cell fate decision ואת ה־second cell fate decision ברמה מולקולרית, הוצגו כמה transcription factors:

1. Oct4
2. Nanog
3. Cdx2
4. Gata4
5. Gata6

Transcription factors צריכים לפעול בגרעין. לכן בצביעות אימונולוגיות שלהם מצפים לראות צביעה גרעינית.

בנוסף הוזכרה DAPI, מולקולה שנכנסת ל־DNA וזורחת בכחול, ולכן משמשת לסימון גרעינים.

Cdx2 ו־Oct4

Cdx2

בשלב ה־morula, Cdx2 מתבטא ב־outer cells ולא ב־inner cells. בהמשך, ב־mid blastocyst ו־late blastocyst, Cdx2 מתבטא ב־trophectoderm, בעוד שה־ICM נקי מצביעת Cdx2.

כלומר, Cdx2 מסמן את הכיוון של outer cells / trophectoderm.

Oct4

לפי השיעור, בשלב ה־morula כל התאים היו אמורים להיצבע ל־Oct4. ב־mid blastocyst, ה־ICM מבטא Oct4 ברמות גבוהות, וגם ה־trophectoderm מבטא Oct4 ברמות נמוכות. ב־late blastocyst, Oct4 כבר אינו מתבטא ב־trophectoderm, אלא ב־ICM.

כלומר, Oct4 קשור לשמירה על הזהות של ה־ICM.

Nanog, Gata4 ו־Salt and Pepper Expression

Nanog

ב־morula, הצביעה ל־Nanog אינה מאפשרת הבחנה ברורה בין inner cells ל־outer cells. ב־blastocyst, רוב התאים שנצבעים נמצאים ב־ICM, אך לא כולם נצבעים באותה עוצמה: חלק חזק, חלק חלש וחלק אינם נצבעים.

לסוג הביטוי הזה קוראים Salt and Pepper Expression: בתוך אוכלוסיית תאים אחת יש תאים שמבטאים את הפקטור ותאים שלא.

Nanog ו־Gata4

בצביעה כפולה ל־Nanog ול־Gata4 רואים ששני הפקטורים מתבטאים בעיקר ב־ICM, אבל באופן mutually exclusive:

• תא שמבטא Nanog אינו מבטא Gata4.
• תא שמבטא Gata4 אינו מבטא Nanog.

בשלבים מוקדמים יותר, למשל סביב 65 ו־72 תאים, הביטוי עדיין נראה salt and pepper. בשלב מאוחר יותר, סביב 108 תאים, תאי Gata4 נוטים להיות קרובים יותר ל־blastocoel, ותאי Nanog פנימיים יותר. סביב 115 תאים, הסידור נעשה ברור יותר: תאי Gata4 נמצאים באזור שמתאים ל־primitive endoderm, ותאי Nanog נמצאים באזור הפנימי שמתאים ל־epiblast.

נשאלה השאלה איך עוברים מסידור salt and pepper לסידור שכבות. הוצעו שתי אפשרויות:

1. Sorting - התאים זזים ומסתדרים במקומות המתאימים.
2. Turn off - תאים שנמצאים במקום מסוים מכבים פקטור אחד ומפעילים/משמרים אחר.

כדי לבדוק זאת משתמשים ב־time-lapse microscopy. במקום להרוג את העובר בצביעה קבועה, מכניסים GFP ללוקוס של Gata4, כך שכל תא שמבטא Gata4 גם זוהר בירוק. במעקב חי רואים שהתאים נעים ומסתדרים, ולכן המודל הדומיננטי שהוצג הוא sorting.

Markers

שני המרקרים שהודגשו בהקשר של primitive endoderm ותוצריו:

בנוסף, K8 הוזכר כמרקר של תאי trophoblast / trophectoderm.

Loss of function - knockout

כדי לבדוק את תפקידם של transcription factors משתמשים ב־knockout. בדוגמה הכללית, אם מוחקים אקסון חיוני בגן, מתקבל אלל לא פונקציונלי. בדרך כלל מתחילים מהטרוזיגוטים ומכליאים זכר ונקבה הטרוזיגוטים.

לפי גנטיקה מנדלית מצפים בערך ל:

• 25% wild type
• 50% heterozygotes
• 25% mutants

אם לא מתקבלים mutants חיים, ייתכן שהגן הוא embryonic lethal. עם זאת, embryonic lethal לא בהכרח אומר שהגן ספציפי להתפתחות עוברית; ייתכן שמדובר בגן בסיסי שכל תא צריך, למשל גן חיוני למטבוליזם.

Oct4 knockout - loss of function

בשלב ה־morula, בעוברים חסרי Oct4 עדיין מתקבלת morula. כלומר, לא צריך Oct4 כדי להגיע עד שלב ה־morula.

בשלב מאוחר יותר נוצרים מבנים שנראים כמו blastocysts, אך העוברים קטנים יותר. כאשר סופרים את התאים, אין הבדל ברור במספר התאים בין wild type, heterozygotes ו־mutants, לא בתאים הפנימיים ולא בתאים החיצוניים. לכן הבעיה אינה נראית כמו מוות תאי או פגם בפרוליפרציה.

Outgrowth culture

בשלב peri-implantation לוקחים עובר ומניחים אותו על צלחת בתנאים שמאפשרים לתאים לחיות. ב־wild type, תאי ה־trophoblast נפרסים על הצלחת, וה־ICM נשאר כגוש מעליהם.

ב־Oct4 mutant, לאחר פריסה רואים בעיקר trophoblasts ולא רואים ICM תקין.

לאחר ארבעה ימים:

• ב־wild type רואים trophoblasts, ICM ותאים של parietal endoderm שנדדו.
• במוטנט רואים trophoblasts בלבד.

כאשר מקלפים את ה־outer cells ומשאירים רק inner cells, ב־wild type ה־ICM נותן epiblast ו־parietal endoderm. לעומת זאת, ב־Oct4 mutant, ה־inner cells מתנהגים כמו trophoblasts.

K8 Immunostaining

K8 הוא מרקר של trophectoderm / trophoblast. כאשר מסירים את ה־outer cells וצובעים ל־K8, רואים שבמוטנט ה־inner cells עצמם מבטאים מרקר של trophoblast.

המסקנה: Oct4 דרוש כדי שה־inner cells יהפכו ל־ICM ולא ל־trophoblast.

Nanog loss of function

בעוברים חסרי Nanog, עד שלב ה־blastocyst המוקדם העוברים נראים יחסית תקינים. כאשר שמים אותם על צלחת, תאי trophoblast נפרסים, אך אין ICM תקין כמו ב־wild type.

אף שהפנוטיפ נראה דומה לזה של Oct4, אין להסיק ש־Oct4 ו־Nanog עושים אותה פונקציה. אם שני גנים היו redundant לגמרי והיו עושים בדיוק את אותה פונקציה, פגיעה באחד מהם לא הייתה אמורה לתת פנוטיפ, כי השני היה מפצה. העובדה שפגיעה בכל אחד מהם נותנת פנוטיפ מלמדת שהם אינם אותה פונקציה.

כאשר מקלפים את ה־outer cells ומשאירים את ה־inner cells:

• ב־wild type מתקבלים epiblast ותאי parietal endoderm שנודדים.
• ב־Nanog mutant מתקבלים בעיקר תאים עם מאפייני parietal endoderm.

בהמשך הוצג גם RT-PCR למרקרים של primitive endoderm, parietal endoderm ו־visceral endoderm, שמראה עלייה במרקרים האלה במוטנטים של Nanog.

המסקנה: במקום שה־ICM ייתן גם epiblast וגם primitive endoderm, בהיעדר Nanog הוא נותן בעיקר primitive endoderm / parietal endoderm-like cells.

המודל: Oct4, Nanog ו־Gata4/6

המודל שנבנה מהניסויים:

1. בשלב ה־morula יש inner cells ו־outer cells.
2. Oct4 דרוש לכך שה־inner cells לא יהפכו ל־trophectoderm, אלא יהפכו ל־ICM.
3. אם פוגעים ב־Oct4, לא נוצר ICM תקין, וה־inner cells מקבלים מאפיינים של trophoblast.
4. Nanog נמצא downstream ביחס ל־Oct4.
5. Nanog מאפשר ל־ICM להפוך ל־epiblast ומונע ממנו להפוך ל־primitive endoderm.
6. אם פוגעים ב־Nanog, לא מתקבל epiblast תקין, ובמקום זאת מתקבלות אוכלוסיות בכיוון primitive endoderm / parietal endoderm.

במובן הזה, Oct4 ו־Nanog הם pluripotency maintaining genes, אבל כל אחד פועל בנקודת זמן אחרת:

Gata4 ו־Gata6

Gata4 ו־Gata6 הם transcription factors נוספים. לפי השיעור, הם עושים תפקיד דומה, והדיון התמקד ב־Gata4.

ב־Gata4 loss of function מתקבל עובר שאין בו primitive endoderm. לכן Gata4 משתתף ב־second cell fate decision ומאפשר ל־ICM להפוך ל־primitive endoderm.

במודל:

• Nanog מקדם epiblast בתאים שבהם הוא מתבטא.
• Gata4 מקדם primitive endoderm.

Nanog, Gata4 ו־cell autonomy

נראה לכאורה שיש סתירה:

• מצד אחד, Nanog מעכב יצירת primitive endoderm בתאים שבהם הוא מתבטא.
• מצד שני, ב־Nanog loss of function כמעט לא רואים ביטוי של Gata4, ולכן Nanog נדרש כדי ש־Gata4 יתבטא.

בנוסף נאמר ש־Nanog נקשר לפרומוטר של Gata4, ובתאים שמבטאים Nanog אין Gata4. מכאן שבתא שבו Nanog מתבטא, הוא פועל כ־repressor של Gata4.

כדי לפתור את הסתירה הוצגו שני מושגים:

לפי המודל:

• באופן cell autonomous, תא שמבטא Nanog נשמר בכיוון epiblast, ו־Nanog מדכא בו את Gata4.
• באופן cell non-autonomous, תא שמבטא Nanog גורם, דרך חלבון אחר שמופרש החוצה, לתא שכן שאינו מבטא Nanog להתחיל לבטא Gata4.
• תא שמבטא Gata4 ילך לכיוון primitive endoderm.

כך Nanog יכול מצד אחד למנוע מתא מסוים להפוך ל־primitive endoderm, ומצד שני להיות נחוץ כדי שתאים אחרים בסביבה יבטאו Gata4 ויהפכו ל־primitive endoderm.

רצף האירועים המרכזי בשיעור

Zygote
  ↓
2-cell embryo
  ↓
4-cell embryo
  ↓
8-cell embryo
  ↓
Morula
  ↓  first cell fate decision
Inner cells + outer cells
  ↓
Early blastocyst + cavitation
  ↓
ICM + trophectoderm
  ↓  second cell fate decision
Epiblast + primitive endoderm
  ↓
Primitive endoderm → visceral endoderm + parietal endoderm