המשך סומיטוגנזה: שעון וגרדיאנט

בשיעור הקודם הגדרנו שני מרכיבים מרכזיים של סומיטוגנזה:

  1. גרדיאנט FGF8 במזודרם הפרה־סומיטי (Presomitic Mesoderm, ‏PSM).
  2. גנים אוסילטוריים (גנים שהביטוי שלהם עולה ויורד במחזוריות).

שני המרכיבים האלה יוצרים יחד את מודל Clock-and-Gradient. המודל המקורי נקרא Clock-and-Wavefront, אבל בשיעור הודגש שה״החזית״ אינה רק קו שנסוג לאחור, אלא גרדיאנט סיגנלי, בעיקר של FGF signaling.

לכן המודל המדויק יותר לענייננו, הוא שעון וגרדיאנט.

גרדיאנט FGF8 במזודרם הפרה־סומיטי נוצר באמצעות RNA decay mechanism. השעתוק החדש של Fgf8 מתרחש בעיקר ב־Tailbud, וככל שתאים מתרחקים ממנו בזמן Axis elongation רמות ה־mRNA והחלבון יורדות.

איך נוצר גרדיאנט FGF8

מקור ה־FGF8 נמצא באזור ה־Tailbud. שם יש שעתוק חדש של Fgf8.

במצגת מופיע גם ציר FGF/Wnt gradient; בשיעור הדגש היה בעיקר על FGF כגרדיאנט שמחזיק את ה־PSM במצב לא ממוין, ומגדיר את אזור הבשלות.

בזמן Axis elongation, תאים שהיו קרובים ל־Tailbud ״נשארים מאחור״ באופן יחסי (להבנתי, דווקא ״נשאים מלפנים״), כי הציר מתארך לכיוון פוסטריורי. בתאים הללו נפסק שעתוק חדש של Fgf8, וה־mRNA שכבר קיים מתחיל להתפרק.

כך מתקבל גרדיאנט:

  • באזור הפוסטריורי, קרוב ל־Tailbud - רמות FGF8 גבוהות.
  • ככל שמתקדמים אנטריורית בתוך ה־PSM - רמות FGF8 יורדות.

זהו RNA decay mechanism: לא צריך לייצר שעתוק חדש בכל נקודה; מספיק שהשעתוק יישאר ב־Tailbud, ושה־mRNA יתפרק בהדרגה בתאים שמתרחקים ממנו.

תפקיד גרדיאנט ה־FGF

רמות FGF signaling גבוהות שומרות על תאי ה־PSM במצב פחות ממוין, שבו הם עדיין לא מוכנים להפוך לסומיט.

כאשר ה־Tailbud מתרחק פוסטריורית, גם גרדיאנט FGF ״נסוג״ לאחור. כך נוצר אזור אנטריורי ב־PSM שבו FGF כבר נמוך. באזור הזה התאים נמצאים במצב בוגר יותר (somite-competent state): הם יכולים להפוך לסומיט, אבל הם עדיין צריכים לקבל את הפולס של השעון.

מודל Clock-and-Gradient: הגרדיאנט של FGF מגדיר את אזור הבשלות, והשעון האוסילטורי קובע מתי תופעל תוכנית הסגמנטציה.

העיקרון:

מרכיב תפקיד
FGF gradient קובע איפה התאים כבר מספיק בוגרים כדי ליצור סומיט
שעון אוסילטורי קובע מתי תופעל תוכנית הסגמנטציה
Mesp2 מסמן את תחילת תוכנית הסגמנטציה באזור שהבשיל

Hes7 - גן השעון

בעובר תרנגולת, אחד הגנים האוסילטוריים שהוצגו הוא cHairy1 בעכבר, ובאדם הדוגמה המרכזית היא Hes7.

cHairy1 בצ׳יק: דפוסי ביטוי שונים בשלבים שונים של אותו מחזור אוסילטורי. Hes7 בעכבר: הביטוי מתחיל באזור הפוסטריורי של ה־PSM, מתקדם לכיוון אנטריורי, ונעצר סמוך לאזור שבו ייווצר הסומיט הבא.

חשוב להבין: זה לא RNA ש״זורם״ פיזית מה־Tailbud לכיוון אנטריורי. כל תא ב־PSM מבטא את Hes7 באופן מחזורי, אבל תאים שונים נמצאים בפאזות שונות של המחזור.

לדוגמה:

  • תא אחד (כחול) יכול להיות בשלב שבו Hes7 גבוה.
  • תא אחר (כתום), באותו זמן בדיוק, יכול להיות בשלב שבו Hes7 נמוך.
  • לאורך זמן, כל תא עובר עלייה וירידה בביטוי.

לכן, בתמונות in situ, זה נראה כאילו גל ביטוי מתקדם לאורך ה־PSM, אבל בפועל, מדובר באוכלוסיית תאים שכל אחד מהם מתנדנד, והפאזות שלהם מסודרות במרחב.

Hes7 Loss of function

ננסה להבין מה התפקיד של Hes7.

כאשר עושים loss of function ל־Hes7, העוברים יכולים להגיע לשלב מאוחר ולהיוולד, אבל יש פגיעה קשה בסגמנטציה של השלד.

Hes7 loss of function: בעובר E9.5 אין ביטוי של Hes7, וביילודים רואים גֵּו קצר וזנב קצר.

הפנוטיפ המרכזי:

תצפית (whole mount) פירוש
עכברים נולדים עם גֵּו קצר וזנב קצר יש פגיעה בבניית הציר האחורי והחוליות
סומיטים נוצרים בצורה לא סדירה ב־E9.5 (אמצע ההריון) יש בעיה בפרגמנטציה של ה־PSM
חוליות וצלעות נראות מאוחות או לא מסודרות הסגמנטציה של השלד נפגעה
חוט השדרה עדיין קיים הבעיה אינה יצירת חוט השדרה עצמו, אלא תבנית החוליות סביבו
ב־Hes7 loss of function רואים פגיעה קשה בסגמנטציה של השלד: החוליות והצלעות אינן מאורגנות כסגמנטים תקינים. חתכים בעכברי Hes7 loss of function: ה־Neural arches וחוליות מאוחות, לצד סומיטים לא סדירים בשלבים עובריים.

המסקנה אינה ש־Hes7 ״יוצר שלד״. השלד עדיין יכול להיווצר במידה מסוימת. הבעיה היא שאין סגמנטציה תקינה: במקום הרבה יחידות מסודרות, מתקבל רצף מאוחה ולא מאורגן.

התפקיד של Hes7 (השעון) הוא בעיקר לייצר סומיטים (מהתפצלות), ולא להכתיב מה ייצא מהם.

Hes7 Gain of function

בניסוי gain of function, הביטוי של Hes7 נעשה קבוע ומתמשך בכל ה־PSM. גם כאן מתקבל פנוטיפ דומה: סומיטים וחוליות מתאחים.

Hes7 gain of function: ביטוי קבוע (לא אוסילטורי) של Hes7 גורם גם הוא לפגיעה בסגמנטציה (גורם להתאחות סומיטים).

המסקנה החשובה היא שצריך את המחזוריות של Hes7, לא רק את הנוכחות שלו. Hes7 אינו גן שמכתיב ״מה יהיה הסומיט״, אלא גן שמשמש כחלק מהשעון שקובע מתי תתרחש הפרגמנטציה.

אפשר לנסח את זה כך:

  • בלי Hes7 - אין שעון תקין.
  • עם Hes7 קבוע ולא מחזורי - גם אין שעון תקין.
  • רק ביטוי מחזורי של Hes7 מאפשר סגמנטציה תקינה.

יצירת ביטוי מחזורי של Hes7

Hes7 הוא transcription factor שפועל כרפרסור של עצמו; הוא מדכא את השעתוק של עצמו, ולכן יוצר משוב שלילי.

שעתוק של Hes7 וחלבון Hes7 מופיעים באופן אקסקלוסיבי:

  • כאשר יש תעתוק של Hes7 אין חלבון.
  • כאשר יש חלבון Hes7 התעתוק מדוכא.
Hes7 transcription ו־Hes7 protein אינם מופיעים באותו זמן. כאשר יש תעתוק של Hes7 אין חלבון, וכאשר יש חלבון Hes7 התעתוק מדוכא. משוב שלילי של Hes7: החלבון שנוצר חוזר לגרעין ומדכא את הפרומוטור של Hes7.

הרצף הבסיסי:

  1. Notch ו־FGF מאפשרים שעתוק של Hes7.
  2. נוצר mRNA של Hes7.
  3. ה־mRNA עובר splicing ויוצא לציטופלזמה.
  4. מתורגם חלבון Hes7.
  5. החלבון חוזר לגרעין.
  6. Hes7 מדכא את הפרומוטור של Hes7 עצמו.
  7. בגלל שה־mRNA והחלבון לא יציבים, הם מתפרקים.
  8. לאחר שהחלבון נעלם, הדיכוי משתחרר, ומתחיל מחזור חדש.

למה צריך דיליי

כדי שמשוב שלילי ייצור אוסילציה, לא מספיק שהחלבון ידכא את עצמו. צריך גם דיליי בין תחילת השעתוק לבין הופעת החלבון הפעיל (כדי שהחלבון שמדכא את השעתוק יופיע רק לאחר שהשעתוק כבר הספיק לעלות).

הדיליי כולל כמה שלבים:

  • שעתוק
  • splicing
  • יציאת mRNA מהגרעין
  • תרגום
  • הבשלת החלבון והגעה לגרעין

ניתן לפרמל את המודל בעזרת delay differential equations. הנקודה הביולוגית העיקרית היא שמשך החיים של ה־mRNA והחלבון, יחד עם הדיליי, קובעים אם תתקבל אוסילציה יציבה.

\[\begin{aligned} &\mathrm{d}p(t)/\mathrm{d}t = \mathrm{a}m(t-T_p) - \mathrm{b}p(t) \\[1em] &\mathrm{d}m(t)/\mathrm{d}t = \mathrm{k}/\left[1 + \left\{\mathcal{p}(t-T_m)/\mathrm{p_0}\right\}^2\right] - \mathrm{c}m(t) \end{aligned}\]

המשוואה הראשונה פירושה כמה חלבון Hes7 פעיל נוצר בכל רגע נתון, בהתאם לכמות ה־mRNA שהייתה זמינה לפני זמן $T_p$ (דיליי של תרגום). החלבון מתפרק בקצב $b$.

המשוואה השנייה מתארת את כמות ה־mRNA הפעיל, בהתאם לדיכוי של החלבון שהופיע לפני זמן $T_m$ (דיליי של השפעת החלבון על השעתוק). ה־mRNA מתפרק בקצב $c$.

הפרמטרים במודל המתמטי של Hes7: כמות mRNA, כמות חלבון, קצבי תרגום ופירוק, ודיליי של mRNA וחלבון.

פרמטר משמעות ביולוגית
p(t) כמות חלבון Hes7 פעיל בתא בזמן נתון
m(t) כמות mRNA פעיל בזמן נתון
$\mathrm{p_0}$ ריכוז החלבון שבו השעתוק של Hes7 מדוכא ב־50%
a קבוע קצב התרגום של Hes7
b קבוע קצב הפירוק של החלבון
c קבוע קצב הפירוק של ה־mRNA
Tm הזמן מתחילת השעתוק עד mRNA בשל בציטופלזמה (הדיליי)
Tp הזמן מתחילת התרגום עד חלבון בשל ופונקציונלי (דיליי נוסף)

שני תנאים חשובים נדרשים לאוסילציה יציבה (פתרון אוסצילטורי למשוואות):

  1. זמן מחצית החיים של תוצרי Hes7 צריך להיות מספיק קצר - גם ה־mRNA וגם החלבון צריכים להתפרק יחסית מהר (הארכת זמן מחצית החיים עלולה לגרום לכך שחלבון נשאר בתא זמן רב יותר וממשיך לדכא את השעתוק של עצמו גם כשהמערכת כבר אמורה להתחיל מחזור חדש. ראו להלן.).
  2. הדיליי הכולל ($T_m + T_p$) צריך להיות מספיק ארוך - חייב להיות פער זמן בין תחילת השעתוק לבין הופעת החלבון המדכא.

שני תנאים לאוסילציה של Hes/her: תוצרים לא יציבים, ודיליי כולל מספיק ארוך.

שינוי קטן בזמן מחצית החיים משנה את הסגמנטציה

במצב תקין של Hes7 בעכבר (Wild type):

  • זמן מחצית החיים של החלבון הוא בערך 20 דקות ($T_{1/2} \approx 20 \, \text{min}$).
  • הדיליי של ה־mRNA הוא בערך 29 דקות ($T_m \approx 29 \, \text{min}$).
  • המחזור כולו מתאים לקצב יצירת סומיט בעכבר: בערך שעתיים.

במוטציה Hes7(K14R) מחליפים חומצת אמינו אחת: ליזין בעמדה 14 מוחלף בארגינין (שתיהן חומצות אמינויות טעונות חיובית, הבדל באורך השייר). זו החלפה יחסית עדינה מבחינת מטען, אבל היא מאריכה את זמן מחצית החיים של החלבון לכ־30 דקות ($T_{1/2} \approx 30 \, \text{min}$). זה משנה את הדינמיקה של השעון באופן משמעותי.

Hes7(K14R): הארכת זמן מחצית החיים של החלבון מ־20 ל־30 דקות גורמת לדעיכת האוסילציה ולפגיעה בסומיטים אחרי כמה מחזורים.

התוצאה: לאחר מספר מחזורים האוסילציה דועכת. הסומיטים הראשונים יכולים להיווצר, אבל הסומיטים הבאים מתאחים.

השינוי הוא ביציבות של החלבון (לא תשמר אוסילציה), אך הפונקציונאליות דווקא נשמרת.

אינטרונים יוצרים חלק מהדיליי

חלק מהדיליי של Hes7 נובע מ־splicing. אם מוציאים אינטרונים מהגן, מקצרים את זמן העיבוד של ה־mRNA.

קיצור הדיליי של mRNA באמצעות הסרת אינטרונים משנה את מחזוריות Hes7 ופוגע בסגמנטציה.

במודל שהוצג (התמונה למעלה):

מצב הגן השפעה על הדיליי זמן מחזור תוצאה צפויה
Wild type $T_m \approx 29 \, \text{min}$ $\text{Period} = 123 \, \text{min}$ אוסילציה תקינה
נשאר רק אינטרון אחד $T_m \approx 24 \, \text{min}$ $\text{Period} = 112 \, \text{min}$ האוסילציה פחות יציבה
גן בלי אינטרונים $T_m \approx 10 \, \text{min}$   האוסילציה מתבטלת וסומיטים מתאחים
  • הסרת חלק מהאינטרונים מקצרת את זמן ה־splicing ולכן את ה־time delay. השעון יכול להמשיך להתנודד, אבל במחזור קצר יותר (112 דקות במקום 123 דקות) - ולכן סומיטים נוצרים מהר יותר.
  • הסרת כל האינטרונים מקצרת את ה־delay בצורה קיצונית, למשל מכ־29 דקות לכ־10 דקות. אז ה־negative feedback חוזר מהר מדי, האוסילציות התקינות קורסות ונוצר איחוי של הסומיטים. התוצאה מוצגת בתמונה הימנית למטה ($\Delta \ln$) - שוב התקבל איחוי (fusion) של הסומיטים.
Uncx4.1 כמרקר לסומיט: ב־Wild type רואים סומיטים מופרדים; ב־K14R נוצרים כמה סומיטים ראשונים ואז איחוי; ב־Hes7 KO יש איחוי חמור.

לכן האינטרונים בהקשר הזה תורמים לזמן העיבוד של ה־mRNA, והזמן הזה הוא חלק ממנגנון השעון.

Notch, ‏Lunatic Fringe וסנכרון השעון

עד כה, אפשר היה לטעות ולחשוב שכל תא ב־PSM מפעיל את השעון שלו לבד. אבל כדי ליצור סומיטים תקינים, התאים צריכים להיות מסונכרנים זה עם זה. כאן נכנס Notch signaling.

Lunatic Fringe הוא חלק ממסלול Notch

Lunatic Fringe ‏(Lfng) הוא אנזים בגולג׳י שמשנה את Notch באמצעות גליקוזילציה, וכך משפיע על היכולת של Notch להגיב לליגנדים שלו.

Lunatic Fringe מתבטא בדפוס אוסילטורי, בדומה ל־Hes7/cHairy1.

בשיעור הודגש ש־Lfng עצמו מתבטא בדפוס מחזורי, כמו Hes7. זה חשוב, כי הוא מחבר בין השעון לבין Notch signaling.

Notch signaling: קישור ליגנד לרצפטור Notch מוביל לשחרור הדומיין התוך־תאי, שנכנס לגרעין ומשפיע על שעתוק.

תזכורת למסלול Notch:

  1. תא אחד מבטא ליגנד כמו Delta-like.
  2. תא סמוך מבטא את הרצפטור Notch.
  3. קשירת הליגנד גורמת לביקועים פרוטאוליטיים ב־Notch.
  4. משתחרר Notch intracellular domain ‏(NICD).
  5. NICD (פקטור שעתוק) נכנס לגרעין ומשפיע על שעתוק גנים.

נזכיר גם שיש אנזימים שיודעים לעשות עליו מודיפיקציות. למשל OFUt, שמוסיף פוקוז, שבלעדיו החלבון לא פונקציונאלי (לא מסוגל לקשור ליגנד). לונאטיק פרינג׳ לעיל הוא אנזים נוסף שמבצע מודיפיקציה, אך פועל בכך שהוא מחליף את הספציפיות של הליגנד.

Notch נדרש לסנכרון Hes7 בין תאים סמוכים

בשלב הבא, נרצה לבחון כיצד Notch מעורב.

עיכוב Notch בדג זברה באמצעות DAPT גורם לאובדן סנכרון של ביטוי Her1.

בניסוי בדג זברה עיכבו את Notch באמצעות DAPT. לאחר העיכוב, ביטוי הגן האוסילטורי Her1 (ההומולוג של Hes7) יצא מסנכרון, והפך לדגם מפוזר של salt-and-pepper.

המסקנה:

  • תאים אכן יכולים להחזיק מנגנון אוסילטורי פנימי.
  • ה־Notch מסנכרן את התאים אחד עם השני.
  • בלי Notch, כל תא יכול להמשיך להתנדנד, אבל הפאזות כבר לא מתואמות, ולכן לא מתקבל גל מסודר.

הערה: דג זברה הוא מודל מוצלח בהקשר הזה, כי ההתפחות העוברית של הדגים מתרחשת מחוץ לרחם (במים). לעוברים של דג זברה יש 32 סומיטים.

בתמונה למעלה DMSO היא מולקולה שלא עושה כלום, ומשמשת לביקורת.

הקשר בין Notch, ‏Hes7 ו־Lfng

נשאלת השאלה איך מראש מבטאים את Hes7. יש שני גורמים שדואגים לביטוי הפוזיטיבי של Hes7:

  1. FGF - מאפשר ביטוי של Hes7 באזור שבו התאים עדיין ב־PSM.
  2. Notch - מפעיל את Hes7 ומסנכרן בין תאים סמוכים.

Notch מפעיל שעתוק של Hes7 ושל Lfng. ה־Hes7, בתור רפרסור, מדכא גם את עצמו וגם את Lfng. ה־Lfng משנה את פעילות Notch, וכך נוצר משוב שמאפשר תנודתיות וסנכרון.

הקשר בין Notch, Hes7 ו־Lunatic Fringe: ה־Notch מפעיל Hes7 ו־Lfng, ו־Hes7 מדכא את עצמו ואת Lfng.

התמונה הכללית:

  • FGF מאפשר ביטוי של Hes7 באזור שבו התאים עדיין ב־PSM.
  • Notch מפעיל Hes7 ומסנכרן בין תאים סמוכים (מפעיל Lfng signaling).
  • Hes7 יוצר משוב שלילי שמייצר מחזוריות. המשוב השלילי הוא גם על עצמו, וגם על Lfng.
  • Lfng משנה את Notch ומוסיף שכבת בקרה מחזורית.

אופן העיכוב שעושה Lfng על רצפטור Notch טרם הובן, והוא אף מתרחש בניגוד לפעילות האנזימטרית המצופה.

Mesp2 ותוכנית הסגמנטציה

כדי שסומיט חדש ייווצר, לא מספיק שתאים יהיו ב־PSM ולא מספיק שיהיה שעון. צריך להפעיל בפועל את תוכנית הסגמנטציה.

הגן המרכזי כאן הוא Mesp2.

Mesp2 מתבטא באזור S-1/S0 ומסמן את תחילת תוכנית הסגמנטציה.

Mesp2 הוא גן בקרה ראשי של יצירת הסומיט (master regulatory gene). הוא מופיע בחלון זמן קצר, באזור שבו הסומיט הבא עומד להיווצר.

התנאים לביטוי Mesp2:

  1. התאים צריכים להיות באזור שבו FGF נמוך - כלומר באזור שבו הם כבר יכולים להתמיין.
  2. צריך להגיע פולס מתאים של Notch activity (Notch מאקטב את Mesp2). קיימים גורמים נוספים, למשל TBX6, שמאפשרים ל־Notch להפעיל את Mesp2.

לכן:

  • הגרדיאנט הפוסטריורי, בעיקר FGF ובהקשר הרחב גם Wnt, קובע איפה התאים עדיין לא בשלים ואיפה הם כבר יכולים להיכנס לתוכנית סגמנטציה.
  • השעון של Notch/Hes7 קובע מתי Mesp2 יופעל.
  • Mesp2 מפעיל את תוכנית הסגמנטציה עצמה.
הקשר בין פעילות Notch, גרדיאנט FGF, ‏Mesp2 ותוכנית הסגמנטציה.

תזכורת: S-1, ‏S0 ו־S1

בסומיטוגנזה משתמשים בסימון טופוגרפי:

סימון משמעות
S-1 האזור ב־PSM שבו הסומיט הבא עומד להיווצר
S0 הסומיט שנוצר זה עתה
S1 הסומיט שכבר נוצר במחזור הקודם

Mesp2 מופיע באזור הסומיט העתידי (S-1), ומכתיב את הגבול שבו תתרחש הפרגמנטציה. הוא לא צריך להישאר דולק לאורך זמן; להפך - ביטוי ממושך מדי יפגע בסדר של התהליך.

פעילות Mesp2 - שינוי התלות של Lfng ב־Notch

סיכום נוסף

Mesp2 מייצר Lfng שמעכב את Notch. מרגע שמופעל Mesp2, הביטוי של Lfng כבר לא תלוי ב־Notch, אלא ב־Mesp2. כך, ‏Lfng יכול לעכב Notch receptor בלי קשר לשעון.

Mesp2 גם מבטא את RIPPLY2, שמעכב את Tbx6 (שנדרש להפעלת Mesp2). כך, ברגע שמופעל Mesp2 (והופעלה תוכנית הסגמנטציה), הוא גם מייצר את המנגנון שמכבה את עצמו.

סיכום של מערכת השעון והגרדיאנט: FGF מגדיר את אזור הבשלות, Notch מסנכרן את השעון, ו־Mesp2 מפעיל את תוכנית הסגמנטציה.

Spondylocostal dysostosis: כשסגמנטציה משתבשת

הקשר לרפואה מופיע בקבוצת מחלות בשם Spondylocostal dysostosis (בקיצור: SCDO). אלה מצבים שבהם יש פגיעה בסגמנטציה של החוליות והצלעות.

SCDO

Spondylocostal dysostosis: פגיעה בסגמנטציה של חוליות וצלעות, לרוב עם גֵּו קצר, צוואר קצר וסקוליוזיס.

מאפיינים מרכזיים:

  • פגמים מרובים בסגמנטציה של החוליות
  • פגיעות בצלעות
  • גֵּו (trunk) קצר ביחס לגובה
  • צוואר קצר
  • לעיתים סקוליוזיס לא מתקדם

הגנים המעורבים קשורים בדיוק למסלולים שלמדנו:

גן קשר לשיעור
DLL3 ליגנד/רכיב במסלול Notch
HES7 גן שעון אוסילטורי
LFNG Lunatic Fringe, בקרה על Notch
MESP2 מפעיל תוכנית סגמנטציה
RIPPLY2 חלק מהתוכנית downstream של Mesp2
TBX6 גורם שמאפשר סגמנטציה תקינה

הנקודה החשובה: אותם גנים שנראים במודל העכבר כחלק ממנגנון סומיטוגנזה, הם גם גנים שמוטציות בהם גורמות למחלה אנושית.

קביעת מספר הסומיטים

מספר הסומיטים נקבע לפי היחס בין שני תהליכים:

  1. Axis elongation - כמה מהר ה־Tailbud מוסיף רקמה פוסטריורית.
  2. קצב השעון הסגמנטלי (סומיטוגנזה) - כל כמה זמן נוצר סומיט חדש.
בקרה על מספר הסומיטים: היחס בין Axis elongation לבין קצב יצירת הסומיטים קובע כמה סומיטים ייווצרו.
  • אם ציר ה־elongation מהיר ביחס לשעון, יש יותר זמן/מרחב לייצר סומיטים נוספים.
  • אם השעון מהיר, נוצרים סומיטים בקצב גבוה יותר.
  • אם השעון איטי, נוצרים פחות סומיטים באותו מרחב התפתחותי.

מספר דורות התאים ובקרת מספר הסומיטים

החלק הבא מרחיב את הדיון בכתה ולא בהכרח משקף את כוונת המרצה.

אי אפשר להשוות בין מינים רק לפי הזמן המוחלט שבו נוצר ציר הגוף, משום שלכל מין יש קצב התפתחות כללי וקצב חלוקת תאים שונים. לדוגמה, תהליך שנמשך זמן רב בנחש אינו בהכרח כולל הרבה יותר פעילות התפתחותית מאשר תהליך קצר יותר בתרנגולת.

לכן, מנרמלים את משך יצירת הציר לפי זמן מחזור התא הממוצע ב־PSM, ומבטאים אותו כמספר דורות תאים:

\[\boxed{ N_{\text{generations}} \approx \frac{T_{\text{somitogenesis}}} {T_{\text{PSM cell cycle}}} }\]

מספר דורות התאים הוא מספר הפעמים שתאי ה־PSM מספיקים לעבור מחזור חלוקה במהלך יצירת כל הסומיטים. זהו מספר יחסי חסר יחידות, לא זמן בשעות.

השוואה בין מינים: מספר הסומיטים משתנה במידה רבה גם כאשר מספר דורות התאים דומה.
מין זמן ליצירת זוג סומיטים זמן מחזור תא ממוצע ב־PSM מספר דורות מספר סומיטים
דג זברה כ־30 דקות כ־5.5 שעות כ־2.8 כ־31–32
תרנגולת כ־90 דקות כ־6.3 שעות כ־13.1 כ־55
עכבר כ־120 דקות כ־8 שעות כ־16.3 כ־65
נחש תירס כ־100 דקות כ־24.4 שעות כ־21.5 כ־315

מספר הסומיטים הכולל תלוי בשני גורמים:

  1. מספר דורות התאים ($N_{\text{generations}}$) - מספר מחזורי התא שעוברים במהלך יצירת הציר וה־PSM.
  2. מספר מחזורי שעון הסגמנטציה בכל מחזור תא - מספר מחזורי שעון הסגמנטציה המתרחשים בכל מחזור תא: $\frac{T_{\text{cell cycle}}}{T_{\text{segmentation clock}}}$.

לכן ניתן לכתוב בקירוב נוסחה למספר זוגות הסומיטים הכולל ($N_{\text{somites}}$):

\[\boxed{ N_{\text{somites}} \approx N_{\text{generations}} \times \frac{T_{\text{cell cycle}}} {T_{\text{segmentation clock}}} }\]

לדוגמה, בנחש:

\[21.5 \times \frac{24.4\ \mathrm{hours}} {1.67\ \mathrm{hours}} \approx 314\]

כלומר, מתקבלים בקירוב כ־315 סומיטים.

מה מלמדת ההשוואה בין הנחש לעכבר ולתרנגולת?

בנחש נוצרים כ־315 סומיטים, לעומת כ־65 בעכבר וכ־55 בתרנגולת. עם זאת, מספר דורות התאים בנחש הוא רק כ־21.5, לעומת כ־16.3 בעכבר וכ־13.1 בתרנגולת.

לכן, מספר הסומיטים העצום בנחש אינו נובע בעיקר מהתארכות הציר במשך הרבה יותר דורות (ההבדל הוא רק פי 1.3–1.6).

ההסבר המרכזי הוא שבנחש, שעון הסגמנטציה מהיר מאוד ביחס לקצב מחזור התא ולקצב הגדילה של ה־PSM. במהלך דור תא יחיד, מתרחשים בנחש הרבה יותר מחזורי שעון, ולכן נוצרים הרבה יותר סומיטים.

חשוב לדייק: השעון של הנחש לא הכי מהיר בזמן מוחלט - בדג זברה זוג סומיטים נוצר בכל כ־30 דקות. ייחודיות הנחש היא בכך שהשעון שלו מהיר מאוד ביחס לקצב ההתפתחות ומחזור התא האיטיים שלו.

הקשר בין קצב השעון לגודל הסומיט

בכל מחזור של שעון הסגמנטציה נוצר בקירוב זוג סומיטים אחד. גודל הסומיט נקבע לפי המרחק שעובר ה־determination front במהלך מחזור שעון אחד:

\[\boxed{ \text{Somite length} \approx \text{determination-front regression speed} \times \text{clock period} }\]

לכן:

  1. מחזור סגמנטלי קצר יותר ← החזית עוברת מרחק קטן יותר בכל מחזור ← נוצרים סומיטים קטנים יותר.
  2. מחזור סגמנטלי ארוך יותר ← החזית עוברת מרחק גדול יותר בכל מחזור ← נוצרים סומיטים גדולים יותר.
  3. כאשר נוצרים יותר סומיטים מאותה כמות יחסית של רקמת PSM, כל סומיט מתחיל בדרך כלל קטן יותר.

מכאן שהשליטה במספר הסומיטים קשורה ישירות גם לשליטה בגודל הסומיט: בנחש נוצרים הרבה סומיטים קטנים, ולא ציר שנוצר במשך מספר גדול במיוחד של דורות תאים.

הנקודה המרכזית: מספר הסומיטים נקבע לפי היחס בין קצב יצירת הסומיטים לבין התארכות הציר. בנחש, ההבדל במספר דורות התאים אינו מספיק כדי להסביר את ריבוי הסומיטים, ולכן קצב השעון וגודל הסומיט הם גורמים מרכזיים.

Gut Formation ו־Ventral Folding

לאחר גסטרולציה ותחילת אורגנוגנזה כבר יש:

  • מערכת עצבים שמתחילה להיווצר באמצעות נוירולציה.
  • סומיטים שנוצרים משני הצדדים של צינור העצבים (Neural tube).
  • התחלה של עמוד השדרה ושרירים.
  • Endoderm שמונח בצד הוונטרלי.

אבל העובר עדיין פתוח בצד הוונטרלי. כדי ליצור גוף סגור צריך:

  1. לסגור את ה־Endoderm לצינור - ה־Gut tube.
  2. לסגור את דופן הגוף ואת חללי הגוף.
  3. למקם מחדש מבנים כמו הלב.
סקירה של Gut formation ו־Ventral folding.

בגסטרולציה, תאים שיצאו דרך ה־Primitive Streak ותרמו ל־Definitive endoderm החליפו בהדרגה את ה־Visceral endoderm באזור העוברי (החלק התחתון בעיור, E7.5). אבל ה־Definitive endoderm עדיין מחובר להמשך החוץ־עוברי שלו, כלומר ל־Visceral endoderm של שק החלמון (Yolk sac).

כדי לקבל Gut tube, צריך להפוך את שכבת ה־Endoderm הפתוחה (שבציור עוטפת את החלק הפנימי), לצינור סגור.

Cardiac Crescent והקשר לקיפול העובר

לפני שנעמיק בקיפול המעיים (gut), צריך לזכור איפה נמצא ה־Cardiac mesoderm.

Cardiac mesoderm מוקדם: תאים קרדיאליים יוצאים מה־Primitive Streak ונודדים ליצירת שדות קרדיאליים.

במהלך הגסטרולציה תאי ה־Cardiac mesoderm יוצאים מה־Primitive Streak, נודדים לטרלית וגם לכיוון אנטריורי/פרוקסימלי, ויוצרים קשת קדמית בשם Cardiac Crescent.

  • השדה הראשון שיוצא מה־Primitive Streak הוא First Heart Field.
  • השדה השני הוא Second Heart Field.
Cardiac Crescent ביחס ל־Neural plate ולציר האנטריורי-פוסטריורי.

בשלב מוקדם, ה־Cardiac Crescent נמצא קדמית מאוד - למעשה מעל/לפני האזור שבו מתחיל להתפתח הראש (החלק האפור בתמונה למטה שנראה כמו לב הוא למעשה המוח). זה לכאורה מוזר, כי הלב הסופי לא נמצא מעל הראש. אבל בזמן הקיפול הוונטרלי והאנטריורי של העובר, האזור הזה זז למיקום הנכון באזור החזה.

בשלב מאוחר יותר ה־Cardiac Crescent יוצר את שדות הלב הראשונים והשניים.

קיפול העובר לסגירת ה־Gut tube משנה את המיקום היחסי של האיברים. הלב מתחיל כאזור קדמי מאוד, ובמהלך הקיפול מגיע לאזור החזה.

תיאור סכמטי של Heart Formation: תאי Cardiac mesoderm יוצרים קשת קדמית ובהמשך יתאחדו ויתארגנו לצינור לבבי.

להלן תמונה שניסיתי לערוך לצורך הבנה:

עובר Pleures
  • אקטודרם - בצבע כחול
  • מזודרם - בצבע אדום
  • אנדודרם - בצבע צהוב

Somatopleure, ‏Splanchnopleure וחללי הגוף

בזמן שהעובר מתקדם באורגנוגנזה, ה־Lateral plate mesoderm עובר שינוי חשוב: הוא עובר MET (מתאים מזינכימליים לתאים אפיתליאליים), ומתחלק לשתי שכבות אפיתליאליות, שביניהן נוצר חלל.

חתך רוחבי בעובר אחרי גסטרולציה: ה־Lateral mesoderm משני הצדדים מתחיל להיפרד לשכבות.

השכבות הן:

שכבה מיקום השכבה אל מה היא צמודה
Somatopleure לטרלית/דורסלית צמודה ל־Ectoderm / Surface ectoderm (שמתפתח לעור)
Splanchnopleure פנימית/ונטרלית צמודה לאנדודרם (שמתפתח לצינור העיכול)

בין שתי השכבות נוצר חלל - Coelomic cavity. בהמשך יתפתחו ממנו חללי הגוף, למשל חלל החזה וחלל הבטן, לפי מיקומם על ציר אנטריורי-פוסטריורי.

חשוב לדייק:

  • Somatopleure קשורה בעיקר לדופן הגוף.
  • Splanchnopleure עוטפת את צינור העיכול ואת האיברים המתפתחים ממנו.
  • ה־Gut tube מוקף במזודרם, וקשור לגוף דרך מבנים מזודרמליים כמו dorsal mesentery.

סגירת ה־Gut Tube ודופן הגוף

יצירת ה־Gut tube מתרחשת בכמה כיוונים, לא רק בקיפול אחד.

קיפול אנטריורי ופוסטריורי

בצד האנטריורי נוצר פתח המעי הקדמי (AIP - Anterior Intestinal Portal). זהו האזור שבו האנדודרם מתחיל להתקפל פנימה וליצור כיס קדמי, ממנו יתפתח החלק הקדמי של המעיים (Foregut).

בצד הפוסטריורי נוצר פתח המעי האחורי (PIP - Posterior Intestinal Portal), שמייצר קיפול דומה לכיוון המעי האחורי (Hindgut).

AIP ו־PIP: סגירת ה־Gut tube מתחילה גם מהצד האנטריורי וגם מהצד הפוסטריורי.

קיפול לטרלי וסגירת צינור העיכול

במקביל, מתרחשת גם סגירה לטרלית: צידי העובר מתקפלים ונעים לכיוון קו האמצע הוונטרלי.

בצדדים, האנדודרם יחד עם ה־Splanchnopleure מתקפלים ונסגרים ליצירת הצינור. בתהליך הזה, חלק מתאי ה־Splanchnopleure עוברים EMT ומייצרים מזנכימה סביב האנדודרם. כך נוצר צינור עיכול שמבפנים הוא אנדודרם ומבחוץ עטוף מזודרם.

קיפול לטרלי: Endoderm ו־Splanchnopleure נסגרים סביב חלל ה־Gut tube.

בסוף שלב זה מתקבל:

  • צינור פנימי של Endoderm.
  • סביבו Splanchnic mesoderm.
  • Coelomic cavity סביב האיברים המתפתחים.
  • חיבור מזודרמלי לגוף דרך מזנטרי (mesentery).

סגירת דופן הגוף

בנפרד מסגירת ה־Gut tube, צריך לסגור גם את דופן הגוף הוונטרלית. כאן מעורבת בעיקר ה־Somatopleure, הצמודה לאקטודרם.

סגירת דופן הגוף הוונטרלית: יש להבחין בין סגירת Gut tube לבין סגירת דופן הגוף.

יש כאן שני תהליכים מקבילים אך לא זהים:

  1. סגירת האנדודרם לצינור עיכול - קשורה ל־Splanchnopleure.
  2. סגירת דופן הגוף - קשורה ל־Somatopleure, ולאקטודרם.

הם קורים במקביל ובאותו אזור מרחבי, ולכן קל להתבלבל ביניהם.

הערה לגבי האיור למעלה: ההמשך של ה־DE הוא ה־VE, כך שקיים הבדל בין האנדודרם שנסגר לבין שק החלמון (שני האזורים הצהובים בציור):

  • Definitive endoderm (DE) - תאי אנדודרם שמקורם ב־Mesendoderm, יוצרים את צינור העיכול. נזכיר שהמקור של המזו־אנדודרם הוא תאי אפיבלסט שעברו Primitive streak.
  • Visceral endoderm (VE) - חוץ־עוברי (Extra-embryonic) לחלוטין במקורו. יוצרים את שק החלמון (Yolk sac).
סגירת איברים מאוחרת

בתמונה למעלה ניתן לראות כבר את חלל הבטן סגור.

טבעת הטבור (Umbilical ring)

במהלך הסגירה נשאר אזור שבו העובר עדיין מחובר לרקמות החוץ־עובריות. זוהי טבעת הטבור, שדרכה יעברו חבל הטבור ומבנים נוספים.

Umbilical ring: אזור החיבור בין העובר לרקמות החוץ־עובריות בזמן סגירת דופן הגוף.

ה־Allantois יתרום בהמשך לחבל הטבור. לכן גם לאחר סגירת דופן הגוף נשאר אזור חיבור מבוקר שדרכו עוברים מבנים חוץ־עובריים.

אינדוקציה של איברי אנדודרם לפי גרדיאנטים

אחרי שהאנדודרם נסגר לצינור, אפשר להתחיל להבין איך נוצרים ממנו איברים כמו Thyroid, ריאות, כבד ולבלב. העיקרון הוא אותו עיקרון שחזר לאורך כל הקורס: מיקום על ציר אנטריורי-פוסטריורי וסביבת סיגנלים קובעים גורל.

התמיינות אזורים שונים לאורך ה־Gut tube לפי מיקום וסיגנלים סביבתיים.

תאי אנדודרם מתפתחים תחת קבלת סיגנלים מהמזודרם סביבם וממבנים סמוכים. לדוגמה:

איבר/אזור עיקרון סיגנלי מהשיעור
Liver / hepatic endoderm דורש שילוב של FGF ו־BMP
Pancreas מיקום ודפוסי סיגנלים שונים מאפשרים הבחנה בין dorsal ו־ventral pancreatic endoderm
Thyroid / lungs / pancreas נוצרים כהנצות מאזורים שונים של ה־Gut tube לפי מיקום וסביבה

לגבי הסיגנלים:

  • FGF מגיע בין היתר מה־Cardiac Crescent. הוא משפיע על האנדודרם; למשל, על האזור שיהפוך ל־Ventral pancreatic endodem. הוא יהיה שונה מה־Dorsal pancreatic endoderm, שנמצע באזור שמקבל גם הרבה Wnt.
  • BMP מגיע ממזנכימה סמוכה.

דוגמה נוספת מהטבלה: כדי שתאי אנדודרם יהפכו לכבד (Hepatic endoderm, באיור למטה מסומן בירוק ובאיור למעלה מסומן בוורוד), נדרשים שני סיגנלים: FGF מהלב ו־BMP מהמזודרם הסמוך. אם אחד מהם חסר, האנדודרם לא יתמיין לכבד.

אזורי endoderm שונים לאורך הצינור: Foregut, ‏Midgut, ‏Hindgut והתחלות של איברים פנימיים.
דוגמאות למיקום איברי Endoderm באדם בשלבים מוקדמים: Thyroid, ‏lung bud, ‏liver, ‏pancreas ואזורי gut שונים. המשך התארגנות ה־Gut tube והאיברים לאורך הציר האנטריורי-פוסטריורי.

הנקודה החשובה היא הבנת העיקרון:

  • לאורך הציר האנטריורי-פוסטריורי נשמרים גרדיאנטים שונים.
  • בכל נקודה, האנדודרם רואה קומבינציה אחרת של סיגנלים.
  • המזודרם שסביב האנדודרם משתתף באינדוקציית איברים.
  • אורגנוגנזה נובעת מאינטראקציה בין שכבות הנבט

רצף האירועים המרכזי

שלב מה קורה
Tailbud יוצר FGF8 נוצר גרדיאנט פוסטריורי-אנטריורי באמצעות RNA decay
FGF גבוה תאי PSM נשמרים במצב לא ממוין
FGF יורד באזור אנטריורי התאים הופכים ל־somite competent
Hes7/cHairy1/Lfng גנים אוסילטוריים שיוצרים את השעון
Notch מסנכרן את האוסילציות בין תאים
Mesp2 מופעל באזור המתאים ומתחיל segmentation program
סומיט חדש נוצר אחרי פרגמנטציה ואפיתליאליזציה
מספר הסומיטים נקבע לפי היחס בין Axis elongation לבין קצב השעון
Gut formation Endoderm נסגר לצינור בעזרת AIP, ‏PIP וקיפול לטרלי
Ventral body wall closure Somatopleure ו־Ectoderm סוגרים את דופן הגוף
אורגנוגנזה של Endoderm מיקום וסיגנלים מהמזודרם קובעים איברים כמו כבד, פנקריאס וריאות
דור פסקל
המשך לשיעור הבא
חזור לסיכום הקודם