שיעורים 23-22 בקרת ביטוי גנים

מדוע תאים בעלי אותו גנום נראים ומתפקדים אחרת?

ברוב התאים בגוף נמצא אותו DNA, ולכן מבחינה עקרונית קיימים בהם אותם גנים. למרות זאת, נוירון אינו נראה כמו תא כבד ואינו מייצר את אותו הרכב חלבונים. גם באותו סוג תא הרכב החלבונים משתנה לאורך מחזור התא ובתגובה למצבי עקה.

ההבדל נוצר משום שבכל תא ובכל זמן מופעלת תוכנית שונה של ביטוי גנים. הבקרה אינה מתרחשת בנקודה אחת בלבד.

שלבי הבקרה

1. בקרה ברמת השעתוק (transcriptional control) - אילו גנים ישועתקו ובאיזו עוצמה.
2. בקרה ברמת העיבוד (RNA-processing control) - כיצד יעובד ה־pre-mRNA.
3. בקרה ברמת הייצוא והמיקום (RNA transport and localization control) - לאן יגיע ה־mRNA בציטופלזמה.
4. בקרה ברמת התרגום (translation control) - האם ומתי ה־mRNA יתורגם.
5. בקרה ברמת פירוק mRNA ‏(mRNA degradation control) - כמה זמן ישרוד ה־mRNA לפני פירוק.
6. בקרה ברמת פירוק חלבון (protein degradation control) - מתי חלבון יפורק.
7. בקרה ברמת פעילות החלבון (protein activity control) - האם חלבון שכבר נוצר יהיה פעיל.

1. בקרות ברמת השעתוק

בקרה באמצעות פקטורי שעתוק

פקטורי שעתוק רגולטוריים נקשרים לרצפי DNA קצרים וספציפיים (לא GTFs), באזורים רגולטוריים. אזורים אלה יכולים להיות רחוקים מהגן שאותו הם מבקרים. קיפול ה־DNA יוצר קרבה פיזית בין האזור הרגולטורי לבין הפרומוטור.

• אקטיבטור נקשר לרוב ל־enhancer ומקדם שעתוק.
• רפרסור נקשר לרצף רגולטורי, כגון silencer, ומפחית שעתוק.
• הפקטור יכול ליצור קשר ישיר עם GTFs, או לגייס קו־אקטיבטורים, ‏Mediator, ‏chromatin remodelers ואנזימים שמשנים היסטונים.

הבקרה כוללת גם עצירה של RNA Pol II סמוך לתחילת הגן, באמצעות גורמים כמו NELF (ראו תמונה B), ולאחר מכן שחרורו ל־elongation. גם שלב ה־elongation עצמו יכול להיות מושפע מחלבונים, ממבנים שניוניים ומהמצב של הכרומטין (תמונה C), אך מנגנונים אלה הוזכרו כחלק ממפת הבקרה ולא נלמדו כאן מחדש.

דימריזציה מגדילה אפיניות וספציפיות

פקטורי שעתוק יכולים להיקשר ל־DNA כמונומרים, אך רבים מהם פועלים כדימרים:

• Homodimer מורכב משתי תת־יחידות זהות.
• Heterodimer מורכב משתי תת־יחידות שונות.

כאשר שתי תת־היחידות יוצרות מגעים עם ה־DNA, מוכר רצף ארוך יותר ונוצרים יותר קשרים. לכן הקישור יכול להיות חזק וספציפי יותר. חלק מהדימרים יציבים עוד לפני ההגעה ל־DNA, ואחרים נוצרים רק לאחר ששני המונומרים נקשרו סמוך זה לזה באזור הרגולטורי.

אותו פקטור שעתוק יכול להתחבר לשותפים שונים ולפעול בקומפלקסים שונים. בהתאם לשותפים שלו, הוא עשוי להשתתף בהפעלת גן מסוים ובדיכוי גן אחר. בקומפלקסים רגולטוריים יכולים להשתתף גם RNAs רגולטוריים ולא רק חלבונים.

פקטורי שעתוק פועלים בקבוצות

ברוב הגנים האאוקריוטיים אין פקטור יחיד שקובע לבדו את רמת השעתוק. כמה פקטורים מצטרפים ל־regulatory committee. מספר הפקטורים, זהותם, מיקומם והאינטראקציות ביניהם קובעים את עוצמת הביטוי.

כאשר שני אקטיבטורים פועלים יחד, ההשפעה יכולה להיות סינרגיסטית: רמת השעתוק המשותפת גבוהה בהרבה מסכום ההשפעות של כל אחד בנפרד. כך אפשר לשמור על ביטוי בסיסי נמוך בעזרת פקטור אחד, ולהעלות במהירות את הביטוי כאשר מצטרף פקטור נוסף.

שלוש דרכים שבהן רפרסור יכול למנוע שעתוק

1. תחרות על אותו רצף DNA - אתרי הקישור של האקטיבטור והרפרסור חופפים, ולכן קישור הרפרסור מונע פיזית את קישור האקטיבטור.
2. Quenching - שני הפקטורים קשורים באתרים נפרדים, אך הרפרסור נקשר לאקטיבטור ומונע ממנו לגייס את הקו־אקטיבטורים הדרושים.
3. חסימת קומפלקס תחילת השעתוק - הרפרסור יוצר אינטראקציה עם GTFs או מייצב קומפלקס לא פעיל, וכך מונע יצירת PIC פעיל.

Insulators, ‏CTCF ותחומי בקרה תלת־ממדיים

Enhancer אינו “יודע” מראש לאיזה פרומוטור הוא שייך. הקרבה התלת־ממדית בתוך הכרומטין קובעת אילו אינטראקציות יכולות להתרחש. כדי למנוע מ־enhancer להשפיע על גן לא מתאים, הכרומטין מאורגן ללולאות ול״שכונות״ רגולטוריות.

CTCF הוא חלבון מרכזי שנקשר ל־insulator sequences, ויוצר גבולות בין אזורי בקרה. בתוך התחום שנוצר, enhancer יכול ליצור מגע עם הפרומוטור המתאים; הגבול מצמצם את מעבר ההשפעו שלו לתחום סמוך.

הלולאות שיוצר CTCF גדולות בהרבה מהלולאה המקומית שמחברת enhancer לפרומוטור. אפשר לקשר אותן למבנה של TADs, מוצע לחזור על השיעור הייעודי בנושא.

כיצד פקטור שעתוק מזהה רצף DNA בלי לפתוח את הדו־גדיל?

הקצוות הכימיים של זוגות הבסיסים חשופים כלפי ה־major groove וה־minor groove. בכל רצף מופיע דפוס אחר של:

• תורמי קשרי מימן.
• מקבלי קשרי מימן.
• קבוצות מתיל הידרופוביות.
• אטומי מימן שאינם משתתפים בקשרי מימן.

משטח הקישור של פקטור השעתוק משלים לדפוס הזה ויוצר סדרה של קשרי מימן, קשרים יוניים ואינטראקציות הידרופוביות. חומצות אמינו יכולות ליצור קשר גם עם הסוכר והפוספט בשלד ה־DNA.

רוב פקטורי השעתוק שנלמדו קוראים את הרצף דרך ה־major groove, משום שהוא מציג מידע כימי עשיר ומובחן יותר. לדוגמה, שייר אספרגין יכול ליצור קשרים עם דפוס מסוים של תורמים ומקבלים בזוג בסיסים; היפוך האוריינטציה של הזוג משנה את הדפוס, וקבוצת המתיל של thymine עלולה ליצור הפרעה סטרית. לכן שינוי של בסיס יחיד יכול לפגוע משמעותית בקישור.

מוטיבים לקישור DNA בפקטורי שעתוק

Helix-turn-helix

HTH ‏(Helix-turn-helix) היה מוטיב הקישור הראשון שתואר. הוא כולל שני α-helices שמחוברים ב־turn קצר. ה־recognition helix נכנס ל־major groove ויוצר את רוב המגעים הספציפיים עם הרצף.

המוטיב נפוץ בפקטורי שעתוק חיידקיים, כגון רפרסורים של אופרונים. חלבונים רבים בעלי HTH נקשרים כדימרים. שתי recognition helices יכולות להיקשר לשני major grooves המופרדים בסיבוב אחד של סליל ה־DNA, כ־3.4 ננומטר.

Homeodomain וחלבוני Hox

Homeodomain הוא מבנה אאוקריוטי שדומה ל־HTH אך בעל הליקס נוסף.

יש לו שלושה α-helices:

• ‏Helices 1/2: דומים ל־HTH,
• Helix 3: פועל כ־recognition helix ב־major groove.

Helix 1 גם יכול להיקשר ל־minor groove, אזור נוסף בקצה החלבון יוצר מגע נוסף עם ה־DNA ותורם לספציפיות.

חלבוני Hox

פחות הרחבנו על הנושא. חלבוני Hox הם דוגמה חשובה לפקטורי שעתוק בעלי homeodomain. הם משתתפים בקביעת הזהות לאורך הציר anterior-posterior במהלך ההתפתחות העוברית. ניסויי ביטוי אקטופי בדרוזופילה המחישו שהמיקום שבו מופעל חלבון Hox קובע את זהות המבנה: הפעלת תוכנית של גפה בראש יכולה להוביל להיווצרות רגל במקום מחוש, והפעלת תוכנית עין באזור אחר יכולה ליצור רקמת עין במיקום חריג.

Leucine zipper

ב־leucine zipper, שתי שרשראות חלבון יוצרות דימר. באזור הדימריזציה מופיעה לאוצין הידרופובית, בקירוב בכל עמדה שביעית, כך ששיירי הלאוצין של שתי השרשראות יוצרים משטח הידרופובי משותף. סמוך אליו, נמצא אזור בסיסי שנקשר ל־major groove.

Helix-loop-helix

Helix-loop-helix ‏(HLH) כולל שני הליקסים שמחוברים בלולאה גמישה. גם כאן, הדימריזציה חיונית, והאזור הבסיסי הסמוך נקשר ל־major groove. ‏Myc הוזכר כדוגמה לפקטור בעל מוטיב כזה.

Zinc finger

ב־zinc finger, יון $\mathrm{Zn^{2+}}$ מייצב מבנה קטן באמצעות קשרים עם שיירי ציסטאין והיסטידין. ה־α-helix של ה־finger נכנס ל־major groove. לחלבון יחיד יכולים להיות כמה zinc fingers ברצף, ולכן הוא אינו חייב ליצור דימר כדי לקרוא רצף ארוך.

Sp1 הוזכר כדוגמה: הוא מכיל שלושה zinc fingers ונקשר למוטיבים עשירים ב־GC, סמוך לפרומוטור (GC box).

β-sheet ו־TBP - קישור רק ל־minor groove

TBP הוא החריג בין הדוגמאות: הוא משתמש במשטח β-sheet כדי להיקשר ל־minor groove של ה־TATA box. הקשרים ההידרופוביים וההחדרה לחריץ הצר מעקמים את ה־DNA בזווית גדולה, בערך $80^\circ$, ומסייעים לפתיחת אזור הפרומוטור.

פתיחת כרומטין וסגירתו

פקטור שעתוק אינו חייב ליצור קשר ישיר עם מכונת השעתוק; הוא יכול לגייס חלבונים שמשנים את הכרומטין המקומי, וכך לאפשר או למנוע גישה לפרומוטור.

ATP-dependent chromatin remodelers

Remodeling complexes יכולים:

• להזיז נוקלאוזום לאורך ה־DNA ולחשוף TATA box או אתר רגולטורי.
• לפנות היסטונים מהאזור.
• להחליף histone variant. דוגמה שהוזכרה היא החלפת H2A, ב־H2A.Z, באזורים הקשורים לשעתוק.

לאחר פתיחת האזור יכולים להיקשר GTFs וחלבונים נוספים.

Writers, ‏erasers ו־readers

• Writers מוסיפים מודיפיקציות להיסטונים.
• Erasers מסירים אותן.
• Readers נקשרים למודיפיקציה ומגייסים חלבונים נוספים.

פקטורי השעתוק מביאים את החלבונים האלה למיקום המתאים בגנום.

מבנה הנוקלאוזום ומודיפיקציות

ליבת הנוקלאוזום כוללת שתי מולקולות מכל אחד מההיסטונים H2A, ‏H2B, ‏H3 ו־H4. זנבות ההיסטונים בולטים החוצה, ויכולים לעבור מודיפיקציות רבות. H3 הוצג כהיסטון בעל מספר גדול במיוחד של אתרי מודיפיקציה.

מודיפיקציות לפתיחה

מודיפיקציות לסגירה

היסטונים יכולים לעבור גם יוביקוויטינציה, כחלק ממגוון המודיפיקציות האפשריות.

מודיפיקציות יכולות להופיע ברצף: פקטור שעתוק מגייס Acetyl-Transferase, קינאז או אנזים נוסף; מודיפיקציה אחת מאפשרת יצירת מודיפיקציה אחרת; ה־readers וה־remodelers מזהים את האזור ומרחיבים את הפתיחה.

רפרסור יכול לבצע את התהליך ההפוך: לגייס remodeler שסוגר את הפרומוטור, histone deacetylase, אנזימים היוצרים H3K9me3 או H3K27me3, וגם חלבונים שמעודדים מתילציית DNA.

2. Alternative splicing כבקרת עיבוד RNA

מאותו pre-mRNA אפשר ליצור כמה mRNAs, ולכן כמה גרסאות של חלבון. ההחלטה אילו splice sites יזוהו תלויה ברצף עצמו ובחלבונים רגולטוריים.

Splice sites חזקים וחלשים

‎5′ splice site, ‏branch point ו־‎3′ splice site מזוהים לפי מידת התאמתם לרצפי קונצנזוס.

• אתר שדומה מאוד לאזור קונצנזוס הוא חזק וסביר שיזוהה ביעילות.
• אתר רחוק מהקונצנזוס הוא חלש, ועלול להיעלם מבחינת הספלייסוזום ללא עזרה נוספת.

המרחק בין האזור הרגולטורי לבין ה־splice site יכול גם להשפיע: אינטראקציה קרובה מתרחשת בדרך כלל בקלות רבה יותר, אך אינטרונים יכולים להיות ארוכים והבקרה אינה מוגבלת רק לרצפים הצמודים לאתר.

SR proteins ו־hnRNP proteins

רצפים רגולטוריים יכולים להימצא בתוך אקסון או בתוך אינטרון:

• SR proteins - מסייעים להציג splice site חלש לספלייסוזום, ולגייס רכיבים כמו U1, ‏BBP, ‏U2AF ו־U2.
• hnRNP proteins - יכולים למסך splice site או אזור רגולטורי, כך שהספלייסוזום לא יזהה אותו.

תוצרים אפשריים של alternative splicing

• Exon skipping - אקסון מסוים אינו נכלל ב־mRNA הבשל.
• Intron retention - אינטרון נשאר בתעתיק. תעתיקים כאלה יכולים להישאר בגרעין או להשתתף בבקרה אחרת; עצם הישארות אינטרון אינה תמיד טעות.
• Alternative 5′ splice site - בחירה בין שני אתרי 5‏′ משנה את גבול האקסון.
• Alternative 3′ splice site - בחירה בין שני אתרי 3‏′ משנה את גבול האקסון.
• בחירה בין אקסונים חלופיים - תאים או מצבים שונים יכולים לכלול אקסון אחד ולדלג על אחר.

אותו גן יכול לעבור splicing שונה בסוגי תאים שונים ואף באותו תא בזמנים שונים. Isoform אחד יכול, לדוגמה, לכלול מקטע transmembrane ואילו isoform קצר יותר יחסר אותו ויוכל להיות מופרש. לכן alternative splicing הוא אחד ההסברים לכך שתאים בעלי אותו גנום מייצרים חלבונים שונים. פגיעה באתרי splicing או בחלבונים הרגולטוריים יכולה ליצור isoforms שגויים ולהשתתף במחלה.

Circular RNA ו־back-splicing

ב־back-splicing קצה splice donor מתחבר ל־splice acceptor שנמצא לפניו, ונוצר RNA מעגלי. תחום ה־circular RNA עדיין נחקר. אחת האפשרויות שהוצגה היא שה־RNA המעגלי משמש כמשטח לקשירת RNA וחלבונים וליצירת קומפלקסים מקומיים.

סיימנו את השיעור הראשון בנושא, החלק הבא הוא השיעור האחרון בקורס.

3. בקרה ברמת הייצוא והמיקום: מיקום mRNA בציטופלזמה

לא כל ה־mRNA מתחיל תרגום מיד לאחר היציאה מהגרעין; לעיתים החלבון דרוש באזור מוגדר בתא, ולכן גם ה־mRNA מועבר לשם לפני התרגום.

המידע בנוגע למיקום הדרוש נמצא בדרך כלל ב־‎3′ UTR, ונקרא לעיתים zipcode. ‏RNA-binding proteins מזהים את הרצף ויוצרים mRNP complex. לאחר היציאה מהגרעין ה־mRNA יכול:

• להתחבר לחלבון motor ולנוע לאורך הציטוסקלטון.
• לנוע בדיפוזיה ולהילכד באזור המטרה.
• להיקשר לחלבוני anchoring שמחזיקים אותו במקום.

mRNA שלא הגיע למיקום הנכון ולא נקשר לעוגן יכול לעבור פירוק, וכך נמנע תרגום של החלבון באזור לא מתאים.

P-bodies ו־stress granules

P-bodies ו־stress granules אינם אברונים עטופי ממברנה. אלה אזורים דינמיים המכילים RNA וחלבונים.

• ב־P-bodies אפשר לאגור mRNA במצב מדוכא תרגומית ולהחזירו בהמשך לציטוזול. באותו אזור יכול להתרחש גם פירוק mRNA.
• ב־stress granules נאגר mRNA כאשר עקה פתאומית עוצרת תרגום. לאחר שהעקה חולפת, ה־granules מתפרקים וה־mRNAs יכולים לחזור לתרגום.

4. בקרות תרגום

בקרת תרגום כללית דרך eIF2

במצבי עקה, התא מפחית את קצב התרגום הכללי כדי לחסוך אנרגיה. אחד המנגנונים המרכזיים לכך פועל דרך פקטור האיתחול eIF2.

במצב רגיל:

1. eIF2-GTP קושר את ה־initiator Met-tRNA, ומביא אותו לתת־היחידה הקטנה.
2. לאחר זיהוי AUG, מתרחשת הידרוליזה של GTP ל־GDP, ו־ eIF2-GDP משתחרר.
3. eIF2B משמש כ־guanine nucleotide exchange factor ומחליף GDP ב־GTP, כך ש־eIF2-GTP יכול להשתתף במחזור נוסף.

בזמן עקה, eIF2 עובר פוספורילציה (מתווספת קבוצת פופסט/זרחן). ‏eIF2-P-GDP נקשר בחוזקה ל־eIF2B ומעכב אותו. תפיסתו מפחיתה את כמות ה־eIF2-GTP הפעיל, ואת מספר אירועי האיתחול.

בקרה ספציפית לכל mRNA דרך ה־‎5′ UTR

ה־‎5′ UTR קובע עד כמה בקלות תת־היחידה הקטנה תגויס, תסרוק את ה־mRNA ותבחר AUG. נלמדו ארבעה מנגנונים.

1. Leaky scanning - אם ה־AUG הראשון חלש, הריבוזום יכול לפסוח עליו ולהתחיל ב־AUG מאוחר יותר.
2. Upstream open reading frame ‏(uORF) - תרגום של reading frame ב־‎5′ UTR יכול להפחית את התרגום של ה־main ORF.
3. Internal ribosome entry site ‏(IRES) - מבנה RNA מאפשר גיוס פנימי של הריבוזום ללא תלות רגילה ב־‎5′ cap.
4. Stem-loop - מבנה שניוני ב־‎5′ UTR יכול לקשור חלבון ולחסום פיזית את הסריקה. דוגמה היא בקרת תרגום של ferritin בהתאם לרמות ברזל.

1. Leaky scanning

איכות ה־Kozak sequence סביב ה־AUG קובעת עד כמה בקלות הוא מזוהה. אם ה־AUG הראשון נמצא ב־Kozak חזק, התרגום מתחיל בו. אם ההקשר חלש, ה־40S יכול לפסוח עליו ולהתחיל ב־AUG מאוחר יותר.

כך אותו mRNA יכול לייצר חלבונים בעלי N-termini שונים. ההבדל עשוי לכלול NLS, אתר פוספורילציה או רצף אחר, המשנה את מיקום החלבון או פעילותו. מנגנון זה מתרחש ברמת התרגום ולא נחשב כ־alternative splicing.

2. Upstream open reading frame ‏(uORF)

uORF הוא reading frame שנמצא ב־‎5′ UTR, לפני ה־main ORF.

• הריבוזום יכול לתרגם את ה־uORF ולהתנתק, ולכן פחות ריבוזומים יגיעו ל־main ORF.
• לעיתים ה־40S נשאר על ה־mRNA, ממשיך לסרוק ומבצע re-initiation, אך התהליך פחות יעיל.
• חלבונים רגולטוריים יכולים למסך את ה־uORF וכך למנוע את זיהויו.
• תרגום ה־uORF יכול ליצור פפטיד שגורם לריבוזום להיתקע. הריבוזום התקוע משמש כמחסום פיזי לסריקה, עד שסיגנל מסוים משחרר את העצירה.

3. Internal ribosome entry site

IRES מאפשר להתחיל תרגום בלי תלות ישירה ב־‎5′ cap.

יש מספר דרכי גיוס:

• מבנה ה־RNA ב־IRES יכול לקשור eIF4G ללא eIF4E, ולגייס 40S.
• 40S יכול להיקשר ישירות למבנה RNA מתאים.
• חלבונים אחרים יכולים לזהות את ה־IRES, ולגייס אליו את תת־היחידה הקטנה.

הקישור ממקם את 40S סמוך ל־AUG פנימי, ולכן אפשר לתרגם אזור שאינו בהכרח זה שהיה נבחר בסריקה מה־cap.

4. Stem-loop והבקרה על ferritin

Ferritin הוא חלבון שיודע לאגור ברזל.

כפי שניתן לצפות:

• כשאין ברזל - אין צורך לייצר ferritin.
• כשיש ברזל - צריך לאגור אותו, אז מייצרים ferritin.

ב־‎5′ UTR של ferritin mRNA נמצא מבנה שניוני של Stem-loop, שיכול להיקשר לחלבון בשם Aconitase. הקישור הזה חוסם את סריקת הריבוזום ואת התחלת התרגום.

Aconitase משנה את הפעילות שלו בהתאם לרמות ברזל:

• בלי ברזל - הוא קושר את הלולאה.
• עם ברזל - הוא מתנתק, כך שמתאפשר תרגום ferritin.

לא הרחבנו על Aconitase מעבר לפעילות האנזימטית לעיל.

סיכום - ארבע הבקרות דרך ‎5′ UTR

בקרות איכות של mRNA בזמן תרגום (RNA surveillance)

בזמן שהריבוזום מתרגם את ה־mRNA, שלושה מנגנונים מטפלים ב־mRNA בעייתי; כל אחד משמש כחיישן לבעיה אחרת:

1. Nonsense-mediated decay ‏(NMD) - מופעל בעקבות קודון עצירה מוקדם.
2. Nonstop decay ‏(NSD) - מופעל כאשר אין ב־mRNA קודון סיום.
3. No-go decay ‏(NGD) - מופעל כאשר הריבוזום נתקע ואינו יכול להמשיך בתרגום.

1. Nonsense-mediated decay

לאחר ספלייסינג, מתווספים באזורי החיבור בין האקסונים חלבוני EJCs ‏(exon junction complexes). כאשר הריבוזום מתקדם לאורך ה־mRNA הוא מסיר אותם.

אם קיים קודון עצירה מוקדם, הריבוזום נעצר לפני שהסיר חלק מה־EJCs. המצב מזוהה כסימן ל־mRNA בעייתי, והוא נשלח לפירוק.

להרחבה על מנגנון ה־NMD, מוזמנים לעיין בשיעור 19.

2. Nonstop decay

ב־NSD אין קודון סיום. הריבוזום ממשיך אל זנב ה־Poly-A, ומתרגם את רצף ה־AAA ל־Poly-Lysine (היינו: AAA...). למרבה הצער, ה־Poly-Lysine גורם לריבוזום להיתקע.

לאחר שהריבוזום נתקע, ה־mRNA ותת־היחידה הקטנה נפרדים מהקומפלקס. חלבוני rescue נקשרים לתת־היחידה הגדולה שנותרה עם ה־tRNA והפפטיד, ומפרידים ביניהם; E2 ו־E3 מסמנים את הפפטיד ביוביקוויטין לפירוק.

3. No-go decay

ב־NGD הריבוזום נתקע בעקבות בעיה ב־mRNA, למשל נוקלאוטיד בעייתי או mRNA חתוך.

גם כאן ה־mRNA נשלח לפירוק, חלבוני rescue מפרקים את קומפלקס התרגום, והפפטיד הבעייתי מסומן ביוביקוויטין באמצעות E2 ו־E3 ונשלח לפירוק.

6. בקרות ברמת פירוק חלבון

אורך החיים ופירוק mRNA תקין

גם mRNA תקין אינו נשאר בציטופלזמה לעד. לאחר היציאה מהגרעין, מתחיל קיצור הדרגתי של ה־poly-A tail. לכן אורך הזנב משתתף בקביעת משך החיים של התעתיק: זנב התחלתי ארוך יותר, מאפשר בדרך כלל זמן ארוך יותר לפני פירוק.

כאשר הזנב מתקצר לכ־25 נוקלאוטידים, התעתיק יכול להתפרק בשני כיוונים:

• הסרת ה־cap ולאחריה פירוק $5’ \to 3’$.
• פירוק $3’ \to 5’$ באמצעות אקסוזום, גם בלי decapping מוקדם.

התהליך יכול להתרחש בציטוזול או בתוך P-bodies.

פירוק מהיר של transferrin receptor mRNA

ב־‎3′ UTR של ה־mRNA המקודד ל־transferrin receptor, נמצא אזור cleavage שיכול להיות ממוסך על ידי Aconitase (שנתקלנו בו מקודם, בהקשר של ferritin).

• כאשר רמת הברזל נמוכה: Aconitase נקשר לאזור ומגן על ה־mRNA מחיתוך. כך נוצר transferrin receptor, שמכניס ברזל לתא.
• כאשר יש מספיק ברזל: הברזל נקשר ל־Aconitase וגורם לו להתנתק. אזור ה־cleavage נחשף, ה־mRNA נחתך ומתפרק במהירות.

בקרה על פירוק חלבונים

חלבונים אינם נשלחים לפרוטאזום רק כאשר התקפלו בצורה שגויה; גם חלבון תקין, שסיים את תפקידו, צריך לעבור פירוק מבוקר.

הפעלת E3 ligase

E3 ligase מזהה את חלבון המטרה וממקם אותו סמוך ל־E2 שנושא יוביקוויטין. אפשר להפעיל E3 באופן סלקטיבי באמצעות:

• פוספורילציה שמשנה את הקונפורמציה שלו.
• קישור ליגנד, כמו סיגנל תוך־תאי או הורמון.
• קישור של תת־יחידה נוספת היוצרת קומפלקס פעיל.

לאחר ההפעלה E3 מזהה את המטרה, E2 בונה polyubiquitin chain והחלבון נשלח לפרוטאזום.

חשיפת degron בחלבון המטרה

אפשר לבקר את הפירוק גם מצד חלבון המטרה. אזור זיהוי הידרופובי או degron עשוי להיות מוסתר ולהיחשף בעקבות:

• פוספורילציה.
• ניתוק חלבון מגן או inhibitor.
• cleavage פיזי של החלבון.

לאחר החשיפה, E3 יכול לזהות את המטרה ולסמן אותה.

8. בקרה על פעילות חלבון

חלבון יכול להיות פעיל מיד לאחר הסינתזה והקיפול, אך חלבונים רבים נוצרים במצב לא פעיל, ומופעלים רק לאחר סיגנל.

דרכי ההפעלה:

• קישור ליגנד שמשנה קונפורמציה.
• פוספורילציה שמשנה פעילות, אינטראקציות או מיקום בתא.
• הרכבת תת־יחידות ליצירת קומפלקס פעיל.
• הסרת מעכב שהיה קשור לחלבון.
• חשיפת NLS: ‏inhibitor יכול למסך nuclear localization signal. לאחר סיגנל הוא מתנתק, ה־NLS נחשף והחלבון נכנס לגרעין. פקטורי שעתוק רבים מבוקרים כך.
• Proteolytic cleavage המשחרר חלק פעיל, למשל חיתוך חלבון מתוך הממברנה.

RNA שאינו מקודד לחלבון

חלק מסוגי ה־RNA כבר נלמדו בהקשרים קודמים:

החלק בשיעור הנוכחי מתמקד ב־lncRNA, ‏miRNA ו־siRNA.

1. Long non-coding RNA ‏(lncRNA)

בדרך כלל, lncRNA מוגדר כ־RNA שאורכו לפחות כ־200 נוקלאוטידים, והוא אינו מתורגם לחלבון. רבים מה־lncRNAs מסונתזים על ידי RNA Pol II, ולכן עוברים capping ו־polyadenylation.

תפקיד מרכזי שהודגש הוא scaffold: מולקולת ה־RNA קושרת כמה חלבונים, ומביאה אותם לאותו אזור כך שיוכלו לפעול יחד. lncRNA יכול ליצור אינטראקציות עם חלבונים, עם RNA או עם DNA.

• פעילות in cis - משפיעה על אותו כרומוזום שממנו נוצר ה־lncRNA.
• פעילות in trans - משפיעה על כרומוזומים אחרים.

Xist ו־X-chromosome inactivation

Xist הוא lncRNA הפועל ב־X-chromosome inactivation. בתאי נקבה יש שני כרומוזומי X, ולכן, ללא מנגנון איזון, הייתה מתקבלת כמות כפולה של תוצרי גנים רבים ביחס לתאי זכר.

בשלב מוקדם בהתפתחות העוברית:

1. בכל תא נבחר באופן אקראי כרומוזום אחד משני כרומוזומי X.
2. Xist מתחיל להתבטא מה־X שנבחר.
3. ה־RNA מצפה את אותו כרומוזום ופועל עליו in cis.
4. הכרומוזום עובר דחיסה והשתקה כמעט מלאה.
5. ההחלטה נשמרת בצאצאי התא, ולכן נוצרים בגוף patches קלונליים שונים.

דפוס זה בולט בחתולות בעלות פרווה שחורה־כתומה: הגן לצבעים האלה נמצא על כרומוזום X, ולכן patches שונים מבטאים את ה־X האימהי או האבהי. הצבע הלבן נובע מגן אוטוזומלי, ואינו חלק ממנגנון Xist.

2. RNA interference ‏(RNAi)

RNAi ‏(RNA interference) הוא מנגנון שבו RNA קצר, מנחה קומפלקס חלבוני אל RNA-מטרה. התוצאה יכולה להיות:

• cleavage ופירוק של ה־mRNA.
• עיכוב תרגום, לעיתים לפני פירוק מאוחר יותר.
• יצירת הטרוכרומטין במסלולים מסוימים הקשורים ל־piRNA (מסלול זה רק הוזכר ולא פורט).

3. microRNA

miRNAs הם RNAs קצרים, באורך של כ־23-20 נוקלאוטידים בתוצר הבשל. הם נוצרים מתעתיק של RNA Pol II ואינם מתורגמים.

יצירת miRNA

1. Pol II משעתק pri-miRNA בעל stem-loop.
2. בגרעין, Drosha מבצע cleavage ויוצר hairpin קצר יותר.
3. ה־pre-miRNA יוצא לציטופלזמה.
4. Dicer מסיר את הלולאה ויוצר duplex קצר.
5. ה־duplex נטען על Argonaute ונוצר RISC.
6. אחד הגדילים מסולק, והגדיל השני נשאר ב־RISC (ונקרא guide strand, לפי המצגת).

זיהוי RNA המטרה

RISC סורק את הציטוזול ומחפש mRNA משלים:

• התאמה כמעט מלאה יכולה להוביל לחיתוך ישיר ולפירוק. מצב זה שכיח יותר בצמחים.
• בתאי בעלי חיים ההתאמה בדרך כלל חלקית. התוצאה העיקרית היא עיכוב תרגום, ובהמשך יכולה להתרחש גם דגרדציה.

miRNA יכול לקדם מעבר של mRNA ל־P-bodies, שבהם הוא יאוחסן או יתפרק.

4. siRNA וניסויי knockdown

siRNA ‏(Small interfering RNA) משתמש ברכיבים דומים ל־miRNA, אך המקור הוא בדרך כלל RNA דו־גדילי חיצוני, למשל RNA ויראלי. RNA דו־גדילי בציטופלזמה מזוהה על ידי Dicer ונחתך ל־siRNAs. אחד הגדילים נטען על Argonaute/RISC ומנחה אותו ל־RNA משלים, שבדרך כלל נחתך ומתפרק.

כך RNAi יכול לשמש כמנגנון הגנה מפני RNA זר.

שימוש במעבדה - shRNA

כדי לבדוק מה תפקידו של חלבון, אפשר להפחית את ביטויו ולבחון את השינוי בתא:

• להכניס siRNA סינתטי, המשלים ל־mRNA הרצוי.
• להכניס וקטור DNA, המקודד ל־shRNA. בגרעין נוצר hairpin, ובהמשך Dicer ו־RISC מעבדים אותו למסלול דומה.

גדיל ה־RNA שנשאר ב־RISC (ה־guide strand) מכוון את RISC ל־mRNA המטרה, גורם לפירוקו, ומפחית מאוד את כמות החלבון. התהליך נקרא knockdown, משום שהביטוי מופחת אך לא בהכרח נעלם לחלוטין.

סיכום מסלולי הבקרה