תרגול 6 העברת אותות תאיים (Signal Transduction)

חלק א׳: מושגים בסיסיים בביואנרגטיקה

אנרגיה חופשית (Free Energy) - $\Delta G$

האנרגיה החופשית של גיבס מבטאת את כמות האנרגיה הזמינה לביצוע עבודה בתגובה כימית בטמפרטורה ולחץ קבועים.

אנתלפיה (Enthalpy) - $\Delta H$

תוכן החום של מערכת מגיבה - משקפת את מספר וסוגי הקשרים הכימיים (קוולנטיים ולא-קוולנטיים) במגיבים ובתוצרים.

אנטרופיה (Entropy) - $\Delta S$

ביטוי כמותי לאקראיות או אי-סדר במערכת.

משוואת גיבס

כאשר:

• $\Delta G$ = שינוי באנרגיה חופשית
• $\Delta H$ = שינוי באנתלפיה
• $T$ = טמפרטורה מוחלטת (קלווין)
• $\Delta S$ = שינוי באנטרופיה

כלל זהב: תגובות ספונטניות מתרחשות כאשר $\Delta G < 0$

חלק ב׳: סוגי רצפטורים להעברת אותות

קיימים ארבעה סוגים עיקריים של רצפטורים להעברת אותות:

1. GPCR (G Protein-Coupled Receptor)

• ליגנד חיצוני ($L$) נקשר לרצפטור ($R$)
• מפעיל חלבון G תוך-תאי שקושר GTP
• מווסת אנזים ($Enz$) המייצר שליח שניוני ($X$)

2. Receptor Tyrosine Kinase (RTK)

• קישור ליגנד מפעיל את פעילות טירוזין קינאז
• הרצפטור מזרחן את עצמו (autophosphorylation)
• מפעיל קסקדת קינאזות ← ביטוי גנים

3. תעלת יונים (Gated Ion Channel)

• התעלה נפתחת או נסגרת בתגובה לריכוז ליגנד או פוטנציאל ממברנה
• מאפשרת כניסת/יציאת יונים (למשל: $\ce{Ca^{2+}}$, $\ce{Na^{+}}$, $\ce{K^{+}}$)

4. רצפטורים גרעיניים (Nuclear Receptors)

• קישור הורמון מאפשר לרצפטור לווסת ביטוי גנים ספציפיים
• הליגנד חודר דרך הממברנה (הורמונים סטרואידיים)

עובדה קלינית: בארה״ב, יותר משליש מכלל התרופות בשוק פועלות נגד רצפטורים מסוג GPCR!

חלק ג׳: חלבוני G (Molecular Switches)

חלבוני G הם “מתגים מולקולריים” - ניתן להדליק ולכבות אותם ע״י החלפת נוקלאוטידים.

מנגנון ההפעלה וההשבתה

[מצב כבוי]                    [מצב דלוק]
G-protein + GDP  ───GEF───►  G-protein + GTP
                  ◄───GAP───

משפחות חלבוני G ותפקידיהן

הערה: באדם קיימים כ-20 תת-יחידות $\alpha$, לפחות 6 $\beta$ ו-11 $\gamma$

חלק ד׳: מסלול GPCR → Adenylyl Cyclase → PKA

שלבי המסלול

שלב 1: $G_s$ עם GDP קשור - כבוי

• לא יכול להפעיל Adenylyl Cyclase

שלב 2: מגע עם קומפלקס הורמון-רצפטור

• גורם להחלפת GDP ב-GTP

שלב 3: $G_{s\alpha}$-GTP מתנתק מ-$\beta\gamma$

• $G_{s\alpha}$ דלוק ומפעיל Adenylyl Cyclase

שלב 4: הידרוליזה של GTP ע״י פעילות GTPase אינטרינזית

• $G_{s\alpha}$ מכבה את עצמו וחוזר להתאחד עם $\beta\gamma$

סינתזה ופירוק של cAMP

הפעלת PKA (Protein Kinase A)

PKA היא קינאזת סרין/תראונין המופעלת ע״י cAMP.

מבנה PKA:

• 2 תת-יחידות רגולטוריות (R) - קושרות cAMP
• 2 תת-יחידות קטליטיות (C) - מזרחנות מצעים

מנגנון ההפעלה:

1. 4 מולקולות cAMP נקשרות לתת-יחידות R
2. תת-יחידות C משתחררות ונהיות פעילות
3. PKA פעיל יכול להיכנס לגרעין ולזרחן את CREB

השפעות PKA

PKA מזרחנת מטרות רבות:

• מטבוליזם: פירוק גליקוגן, ליפוליזה
• ביטוי גנים: זרחון CREB ← שעתוק גנים
• זיכרון ולמידה: פלסטיות סינפטית

הפסקת הסיגנל - שלושה מנגנונים

תהליך הדסנסיטיזציה בפירוט

1. קישור אפינפרין לרצפטור $\beta$-אדרנרגי
2. $G_{s\beta\gamma}$ מגייס את $\beta$ARK לממברנה
3. $\beta$ARK מזרחן שיירי Ser בקצה ה-C של הרצפטור
4. $\beta$-Arrestin נקשר לרצפטור המזורחן
5. קומפלקס רצפטור-ארסטין נכנס לתא באנדוציטוזה
6. בווזיקולה: ארסטין מתנתק, הרצפטור מפורחן וחוזר לממברנה

חלק ה׳: רעלן הכולרה (Cholera Toxin)

מנגנון הפעולה

רעלן הכולרה מבצע ADP-ריבוזילציה של $G_{s\alpha}$:

התוצאה:

• פעילות ה-GTPase של $G_{s\alpha}$ מושבתת
• $G_{s\alpha}$ נשאר במצב דלוק לצמיתות
• Adenylyl Cyclase פעיל כל הזמן ← עלייה מתמדת ב-cAMP

ביטוי קליני:

• עלייה ב-cAMP בתאי אפיתל המעי
• יציאת $\ce{Cl^{-}}$ ומים לחלל המעי
• שלשול חמור האופייני לכולרה

Pertussis toxin (שעלת) פועל הפוך - מעכב את $G_i$ ע״י ADP-ריבוזילציה

חלק ו׳: מסלול GPCR → PLC → PKC

המסלול

1. GPCR מופעל ומפעיל $G_q$
2. $G_{q\alpha}$ מפעיל Phospholipase C-$\beta$ (PLC$\beta$)
3. PLC$\beta$ מפרק $PI(4,5)P_2$ (PIP₂) לשני שליחים שניוניים:

תפקיד השליחים השניוניים

הפעלת PKC (Protein Kinase C)

PKC מופעלת ע״י שילוב של:

• DAG (בממברנה)
• $\ce{Ca^{2+}}$ (מה-ER)
• Phosphatidylserine (בממברנה)

חשוב: PKC היא קינאזת סרין/תראונין (כמו PKA)

חלק ז׳: מסלול הראייה - Rhodopsin ו-Transducin

סקירת המסלול

מסלול ייחודי בתאי הקנים (Rods) ברשתית המשתמש ב-$G_t$ (Transducin).

שלבי העירור (Excitation)

שלב 1: ספיגת אור

• אור ממיר 11-cis-retinal ל-all-trans-retinal
• Rhodopsin (Rh) מופעל

שלב 2: הפעלת Transducin

• Rh* גורם להחלפת GDP ב-GTP על $T_\alpha$
• $T_\alpha$-GTP מתנתק מ-$T_{\beta\gamma}$

שלב 3: הפעלת PDE

• $T_\alpha$-GTP נקשר ל-cGMP Phosphodiesterase (PDE)
• מסיר את תת-היחידה המעכבת (I)

שלב 4: פירוק cGMP

• PDE פעיל מפרק cGMP ל-5’-GMP
• ריכוז cGMP יורד מתחת לסף

שלב 5: סגירת תעלות קטיונים

• תעלות cGMP-gated נסגרות
• מניעת כניסת $\ce{Na^{+}}$ ו-$\ce{Ca^{2+}}$
• היפרפולריזציה של הממברנה ← סיגנל למוח

שלבי ההתאוששות (Recovery/Adaptation)

שלב 6: יציאת $\ce{Ca^{2+}}$

• $\ce{Ca^{2+}}$ ממשיך לצאת דרך מחליף $\ce{Na^{+}}/\ce{Ca^{2+}}$
• ריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ ציטוזולי יורד

שלב 7: הפעלת Guanylyl Cyclase

• ירידה ב-$[\ce{Ca^{2+}}]$ מפעילה GC
• GC מסנתז cGMP מחדש
• תעלות נפתחות ← חזרה למצב “חושך”

שלב 8: השבתת Rhodopsin

• Rhodopsin Kinase (RK) מזרחן Rh* (מועדף ב-$[\ce{Ca^{2+}}]$ נמוך)
• Arrestin (Arr) נקשר ל-Rh* המזורחן ← עיכוב

שלב 9: התחדשות Rhodopsin

• ארסטין מתנתק
• Rh* מפורחן
• all-trans-retinal מוחלף ב-11-cis-retinal
• Rhodopsin מוכן למחזור נוסף

נקודת מפתח: $G_t$ (Transducin) גורם לירידה ב-cGMP ולסגירת תעלות - הפוך מ-$G_s$!

חלק ח׳: מסלול האינסולין - Receptor Tyrosine Kinase

מבנה רצפטור האינסולין

• תת-יחידות $\alpha$: חוץ-תאיות, קושרות אינסולין
• תת-יחידות $\beta$: חוצות ממברנה, בעלות פעילות טירוזין קינאז

שלבי המסלול

שלב 1: קישור אינסולין

• הרצפטור עובר אוטופוספורילציה על שיירי Tyr

שלב 2: גיוס IRS-1

• רצפטור האינסולין מזרחן את IRS-1 על שיירי Tyr

שלב 3: גיוס Grb2-SOS

• דומיין SH2 של Grb2 נקשר ל-pTyr על IRS-1
• SOS (Son of Sevenless) נקשר ל-Grb2

שלב 4: הפעלת Ras

• SOS משמש כ-GEF עבור Ras
• SOS גורם לשחרור GDP וקישור GTP ל-Ras
• Ras-GTP מופעל

שלב 5: קסקדת MAPK

• Ras-GTP מגייס ומפעיל Raf-1 (MAPKKK)
• Raf-1 מזרחן ומפעיל MEK (MAPKK) על Ser
• MEK מזרחן ומפעיל ERK (MAPK) על Thr ו-Tyr

שלב 6: כניסה לגרעין

• ERK מזורחן נכנס לגרעין
• מזרחן פקטורי שעתוק כמו Elk1

שלב 7: ביטוי גנים

• Elk1 מזורחן מתחבר ל-SRF
• מעודד שעתוק גנים הנדרשים לחלוקת תאים

סיכום רכיבי המסלול

חלק ט׳: שאלות תרגול

שאלה 1 - מבנה GPCR

כמה אזורים הידרופיליים יש ב-GPCR טיפוסי?

תשובה: 8 (שמונה)

הסבר: GPCR בנוי מ-7 קטעים טרנסממברניים (הידרופוביים). בין הקטעים ומחוצה להם יש אזורים הידרופיליים:

• 3 לולאות חוץ-תאיות + קצה N-טרמינלי = 4 אזורים חוץ-תאיים
• 3 לולאות תוך-תאיות + קצה C-טרמינלי = 4 אזורים תוך-תאיים
• סה״כ: 8 אזורים הידרופיליים

שאלה 2 - חלבוני G

מה נכון לגבי G-proteins?

1. מופעלים ע״י זרחון
2. מופעלים ע״י GAP
3. מזרחנים חלבוני מטרה
4. הידרוליזה של GTP מפסיקה את הפעילות שלהם

תשובה: 4

הסבר:

• ❌ (1) מופעלים ע״י החלפת GDP ב-GTP, לא ע״י זרחון
• ❌ (2) GAP מכבה את החלבון (מאיץ הידרוליזה)
• ❌ (3) G-proteins לא מזרחנים - הם מפעילים אנזימים אחרים
• ✅ (4) הידרוליזת $GTP \to GDP + P_i$ מכבה את החלבון

שאלה 3 - PKA

הפעלה של Adenylyl Cyclase תגרום להפעלה של?

1. G-Protein
2. GPCR
3. PKA
4. PKC

תשובה: 3 (PKA)

הסבר:

• AC מייצר cAMP
• cAMP נקשר לתת-יחידות הרגולטוריות של PKA
• תת-יחידות קטליטיות משתחררות ומזרחנות מצעים

שאלה 4 - השפעות PKA

פעילות יתר של PKA תגרום ל-?

1. רמות גבוהות של גלוקוז בדם
2. ביטוי גנים
3. רמות גבוהות של חומצות שומן בדם
4. כל התשובות נכונות

תשובה: 4 (כל התשובות נכונות)

הסבר:

• ✅ גלוקוז: PKA מפעיל glycogen phosphorylase ← פירוק גליקוגן ← גלוקוז
• ✅ ביטוי גנים: PKA מזרחן CREB ← שעתוק גנים
• ✅ חומצות שומן: PKA מפעיל hormone-sensitive lipase ← ליפוליזה

שאלה 5 - PKC

שתי מוטציות באנזים PKC באתרים שקושרים סידן ו-DAG יגרמו ל-?

1. חוסר פעילות של PKC
2. עודף פעילות של PKC
3. המוטציות לא ישפיעו על הפעילות
4. אין מספיק נתונים

תשובה: 4 (אין מספיק נתונים)

הסבר: לא נאמר מה סוג המוטציות:

• מוטציות Loss-of-function ← חוסר פעילות
• מוטציות Gain-of-function (constitutively active) ← עודף פעילות
• ללא מידע על טיב המוטציה, אי אפשר לקבוע

שאלה 6 - Transducin

הפעלה של $G_t$-protein תגרום ל-?

1. עליה בריכוז של DAG וסידן
2. עליה בריכוז של cAMP
3. הפעלה של PDE שמוריד את ריכוז ה-cAMP
4. ירידה בריכוז הסידן בתוך התא

תשובה: 4 (ירידה בריכוז הסידן בתוך התא)

הסבר:

• $G_t$ (Transducin) מפעיל cGMP-PDE
• PDE מפרק cGMP
• ירידה ב-cGMP ← סגירת תעלות cGMP-gated
• תעלות אלה מעבירות $\ce{Na^{+}}$ ← ו-$\ce{Ca^{2+}}$
• סגירתן ← ירידה בכניסת $\ce{Ca^{2+}}$ ← ירידה בריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ הציטוזולי

שאלה 7 - מסלול אינסולין

איזה מהחלבונים הבאים משמש כ-GEF במסלול של אינסולין?

1. Grb2
2. SOS
3. Raf-1
4. IRS-1

תשובה: 2 (SOS)

הסבר:

• SOS = Son of Sevenless
• SOS הוא GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) עבור Ras
• גורם להחלפת GDP ב-GTP על Ras ← הפעלת Ras

שאלה 8 - מקרה קליני: רצפטור $\beta$-אדרנרגי

גבר בן 32 פונה לרופא עם:

• עייפות כרונית
• ירידה בלחץ הדם
• קושי בריכוז
• ירידה בלחץ הדם בעמידה
• ריכוז נמוך של גלוקוז
• ירידה ברמות קורטיזול

איזה מנגנון נפגע?

תשובה: ד. חוסר הפעלה של חלבון $G_s$ והפחתת רמות cAMP בתא

הסבר:

• רצפטור $\beta$-אדרנרגי → $G_s$ → Adenylyl Cyclase → cAMP → PKA
• פגיעה במסלול זה בתאי האדרנל תגרום:
  • ↓ קורטיזול (דרוש cAMP לסינתזה)
  • ↓ גלוקוז (קורטיזול מעודד גלוקונאוגנזה)
  • ↓ לחץ דם (תגובה לאדרנלין)

שאלה 9 - מקרה קליני: ראיית לילה

נער בן 16 עם קושי בראייה בחושך, תפקוד לקוי של תאי Rods. איזה מנגנון נפגע?

תשובה: ד. פירוק של cGMP ע״י פוספודיאסטרז לאחר הפעלת Rhodopsin

הסבר:

מסלול הראייה בתאי Rods:

פגיעה בפירוק cGMP ע״י PDE תמנע העברת סיגנל האור ← קושי בראייה בחושך.

סיכום: השוואה בין מסלולי GPCR