תרגול 6 העברת אותות תאיים (Signal Transduction)

חלק א׳: מושגים בסיסיים בביואנרגטיקה

אנרגיה חופשית (Free Energy) - $\Delta G$

האנרגיה החופשית של גיבס מבטאת את כמות האנרגיה הזמינה לביצוע עבודה בתגובה כימית בטמפרטורה ולחץ קבועים.

אנתלפיה (Enthalpy) - $\Delta H$

תוכן החום של מערכת מגיבה - משקפת את מספר וסוגי הקשרים הכימיים (קוולנטיים ולא-קוולנטיים) במגיבים ובתוצרים.

אנטרופיה (Entropy) - $\Delta S$

ביטוי כמותי לאקראיות או אי-סדר במערכת.

משוואת גיבס

כאשר:

• $\Delta G$ = שינוי באנרגיה חופשית
• $\Delta H$ = שינוי באנתלפיה
• $T$ = טמפרטורה מוחלטת (קלווין)
• $\Delta S$ = שינוי באנטרופיה

כלל זהב: תגובות ספונטניות מתרחשות כאשר $\Delta G < 0$

חלק ב׳: רצפטורים להעברת אותות

קיימים ארבעה סוגים עיקריים של רצפטורים להעברת אותות:

1. GPCR (G Protein-Coupled Receptor)

• ליגנד חיצוני ($L$) נקשר לרצפטור ($R$)
• מפעיל חלבון G תוך-תאי שקושר GTP
• מווסת אנזים ($Enz$) המייצר שליח שניוני ($X$)

2. Receptor Tyrosine Kinase (RTK)

• קישור ליגנד מפעיל את פעילות טירוזין קינאז
• הרצפטור מזרחן את עצמו (autophosphorylation)
• מפעיל קסקדת קינאזות ← ביטוי גנים

3. תעלת יונים (Gated Ion Channel)

• התעלה נפתחת או נסגרת בתגובה לריכוז ליגנד או פוטנציאל ממברנה
• מאפשרת כניסת/יציאת יונים (למשל: $\ce{Ca^{2+}}$, $\ce{Na^{+}}$, $\ce{K^{+}}$)

4. רצפטורים גרעיניים (Nuclear Receptors)

• קישור הורמון מאפשר לרצפטור לווסת ביטוי גנים ספציפיים
• הליגנד חודר דרך הממברנה (הורמונים סטרואידיים)

עובדה קלינית: בארה״ב, יותר משליש מכלל התרופות בשוק פועלות נגד רצפטורים מסוג GPCR!

חלק ג׳: חלבוני G (Molecular Switches)

חלבוני G הם “מתגים מולקולריים” - ניתן להדליק ולכבות אותם ע״י החלפת נוקלאוטידים.

מנגנון ההפעלה וההשבתה

[מצב כבוי]                    [מצב דלוק]
G-protein + GDP  ───GEF───►  G-protein + GTP
                ◄───GAP───

משפחות חלבוני G ותפקידיהן

הערה: באדם קיימים כ-20 תת-יחידות $\alpha$, לפחות 6 $\beta$ ו-11 $\gamma$

חלק ד׳: מסלול GPCR → Adenylyl Cyclase → PKA

שלבי המסלול

שלב 1: $\mathrm{G_s}$ עם GDP קשור - כבוי

• לא יכול להפעיל Adenylyl Cyclase

שלב 2: מגע עם קומפלקס הורמון-רצפטור

• גורם להחלפת GDP ב-GTP

שלב 3: $\mathrm{G_{s\alpha}-GTP}$ מתנתק מ-$\beta\gamma$

• $\mathrm{G_{s\alpha}}$ דלוק ומפעיל Adenylyl Cyclase

שלב 4: הידרוליזה של GTP ע״י פעילות GTPase אינטרינזית

• $\mathrm{G_{s\alpha}}$ מכבה את עצמו וחוזר להתאחד עם $\beta\gamma$

סינתזה ופירוק של cAMP

הפעלת PKA (Protein Kinase A)

PKA היא קינאזת סרין/תראונין המופעלת ע״י cAMP.

מבנה PKA:

• 2 תת-יחידות רגולטוריות (R) - קושרות cAMP
• 2 תת-יחידות קטליטיות (C) - מזרחנות מצעים

מנגנון ההפעלה:

1. 4 מולקולות cAMP נקשרות לתת-יחידות R
2. תת-יחידות C משתחררות ונהיות פעילות
3. PKA פעיל יכול להיכנס לגרעין ולזרחן את CREB

השפעות PKA

PKA מזרחנת מטרות רבות:

• מטבוליזם: פירוק גליקוגן, ליפוליזה
• ביטוי גנים: זרחון CREB ← שעתוק גנים
• זיכרון ולמידה: פלסטיות סינפטית

הפסקת הסיגנל - שלושה מנגנונים

תהליך הדסנסיטיזציה בפירוט

1. קישור אפינפרין לרצפטור $\beta$-אדרנרגי
2. $\mathrm{G_{s\beta\gamma}}$ מגייס את $\beta$ARK לממברנה
3. $\beta$ARK מזרחן שיירי Ser בקצה ה-C של הרצפטור
4. $\beta$-Arrestin נקשר לרצפטור המזורחן
5. קומפלקס רצפטור-ארסטין נכנס לתא באנדוציטוזה
6. בווזיקולה: ארסטין מתנתק, הרצפטור מפורחן וחוזר לממברנה

חלק ה׳: רעלן הכולרה (Cholera Toxin)

מנגנון הפעולה

רעלן הכולרה מבצע ADP-ריבוזילציה של $\mathrm{G_{s\alpha}}$:

התוצאה:

• פעילות ה-GTPase של $\mathrm{G_{s\alpha}}$ מושבתת
• $\mathrm{G_{s\alpha}}$ נשאר במצב דלוק לצמיתות
• Adenylyl Cyclase פעיל כל הזמן ← עלייה מתמדת ב-cAMP

ביטוי קליני:

• עלייה ב-cAMP בתאי אפיתל המעי
• יציאת $\ce{Cl^{-}}$ ומים לחלל המעי
• שלשול חמור האופייני לכולרה

Pertussis toxin (שעלת) פועל הפוך - מעכב את $G_i$ ע״י ADP-ריבוזילציה

חלק ו׳: מסלול GPCR → PLC → PKC

המסלול

1. GPCR מופעל ומפעיל $\mathrm{G_q}$
2. $\mathrm{G_{q\alpha}}$ מפעיל Phospholipase C-$\beta$ (PLC$\beta$)
3. PLC$\beta$ מפרק $PI(4,5)P_2$ (PIP₂) לשני שליחים שניוניים:

תפקיד השליחים השניוניים

הפעלת PKC (Protein Kinase C)

PKC מופעלת ע״י שילוב של:

• DAG (בממברנה)
• $\ce{Ca^{2+}}$ (מה-ER)
• Phosphatidylserine (בממברנה)

חשוב: PKC היא קינאזת סרין/תראונין (כמו PKA)

חלק ז׳: מסלול הראייה - Rhodopsin ו-Transducin

סקירת המסלול

מסלול ייחודי בתאי הקנים (Rods) ברשתית המשתמש ב-$\mathrm{G_t}$ (Transducin).

שלבי העירור (Excitation)

שלב 1: ספיגת אור

• אור ממיר 11-cis-retinal ל-all-trans-retinal
• Rhodopsin (Rh) מופעל

שלב 2: הפעלת Transducin

• Rh* גורם להחלפת GDP ב-GTP על $T_\alpha$
• $T_\alpha$-GTP מתנתק מ-$T_{\beta\gamma}$

שלב 3: הפעלת PDE

• $T_\alpha$-GTP נקשר ל-cGMP Phosphodiesterase (PDE)
• מסיר את תת-היחידה המעכבת (I)

שלב 4: פירוק cGMP

• PDE פעיל מפרק cGMP ל-5’-GMP
• ריכוז cGMP יורד מתחת לסף

שלב 5: סגירת תעלות קטיונים

• תעלות cGMP-gated נסגרות
• מניעת כניסת $\ce{Na^{+}}$ ו-$\ce{Ca^{2+}}$
• היפרפולריזציה של הממברנה ← סיגנל למוח

שלבי ההתאוששות (Recovery/Adaptation)

שלב 6: יציאת $\ce{Ca^{2+}}$

• $\ce{Ca^{2+}}$ ממשיך לצאת דרך מחליף $\ce{Na^{+}}/\ce{Ca^{2+}}$
• ריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ ציטוזולי יורד

שלב 7: הפעלת Guanylyl Cyclase

• ירידה ב-$[\ce{Ca^{2+}}]$ מפעילה GC
• GC מסנתז cGMP מחדש
• תעלות נפתחות ← חזרה למצב “חושך”

שלב 8: השבתת Rhodopsin

• Rhodopsin Kinase (RK) מזרחן Rh* (מועדף ב-$[\ce{Ca^{2+}}]$ נמוך)
• Arrestin (Arr) נקשר ל-Rh* המזורחן ← עיכוב

שלב 9: התחדשות Rhodopsin

• ארסטין מתנתק
• Rh* מפורחן
• all-trans-retinal מוחלף ב-11-cis-retinal
• Rhodopsin מוכן למחזור נוסף

נקודת מפתח: $\mathrm{G_t}$ (Transducin) גורם לירידה ב-cGMP ולסגירת תעלות - הפוך מ-$\mathrm{G_s}$!

חלק ח׳: מסלול האינסולין - Receptor Tyrosine Kinase

מבנה רצפטור האינסולין

• תת-יחידות $\alpha$: חוץ-תאיות, קושרות אינסולין
• תת-יחידות $\beta$: חוצות ממברנה, בעלות פעילות טירוזין קינאז

שלבי המסלול

שלב 1: קישור אינסולין

• הרצפטור עובר אוטופוספורילציה על שיירי Tyr

שלב 2: גיוס IRS-1

• רצפטור האינסולין מזרחן את IRS-1 על שיירי Tyr

שלב 3: גיוס Grb2-SOS

• דומיין SH2 של Grb2 נקשר ל-pTyr על IRS-1
• SOS (Son of Sevenless) נקשר ל-Grb2

שלב 4: הפעלת Ras

• SOS משמש כ-GEF עבור Ras
• SOS גורם לשחרור GDP וקישור GTP ל-Ras
• Ras-GTP מופעל

שלב 5: קסקדת MAPK

• Ras-GTP מגייס ומפעיל Raf-1 (MAPKKK)
• Raf-1 מזרחן ומפעיל MEK (MAPKK) על Ser
• MEK מזרחן ומפעיל ERK (MAPK) על Thr ו-Tyr

שלב 6: כניסה לגרעין

• ERK מזורחן נכנס לגרעין
• מזרחן פקטורי שעתוק כמו Elk1

שלב 7: ביטוי גנים

• Elk1 מזורחן מתחבר ל-SRF
• מעודד שעתוק גנים הנדרשים לחלוקת תאים

סיכום רכיבי המסלול

חלק ט׳: שאלות תרגול

שאלה 1 - מבנה GPCR

כמה אזורים הידרופיליים יש ב-GPCR טיפוסי?

1. 6
2. 7
3. 8
4. אי אפשר לדעת, כי יש הבדל בין GPCR-ים שונים.

פתרון

תשובה: 8 (שמונה)

הסבר: GPCR בנוי מ-7 קטעים טרנסממברניים (הידרופוביים). בין הקטעים ומחוצה להם יש אזורים הידרופיליים:

• 3 לולאות חוץ-תאיות + קצה N-טרמינלי = 4 אזורים חוץ-תאיים
• 3 לולאות תוך-תאיות + קצה C-טרמינלי = 4 אזורים תוך-תאיים
• סה״כ: 8 אזורים הידרופיליים

שאלה 2 - חלבוני G

מה נכון לגבי G-proteins?

1. מופעלים ע״י זרחון
2. מופעלים ע״י GAP
3. מזרחנים חלבוני מטרה
4. הידרוליזה של GTP מפסיקה את הפעילות שלהם

פתרון

תשובה: 4

הסבר:

• ❌ (1) מופעלים ע״י החלפת GDP ב-GTP, לא ע״י זרחון
• ❌ (2) GAP מכבה את החלבון (מאיץ הידרוליזה)
• ❌ (3) G-proteins לא מזרחנים - הם מפעילים אנזימים אחרים
• ✅ (4) הידרוליזת $\ce{GTP -> GDP + P_i}$ מכבה את החלבון

שאלה 3 - PKA

הפעלה של אדינליל ציקלאז (Adenylyl Cyclase) תגרום להפעלה של?

1. G-Protein
2. GPCR
3. PKA
4. PKC
5. תשובות 3-1 נכונות

פתרון

תשובה: 3 (PKA)

הסבר:

\[\text{Adenylyl Cyclase} \to \uparrow\text{cAMP} \to \text{PKA activated}\]

• AC מייצר cAMP
• cAMP נקשר לתת-יחידות הרגולטוריות של PKA
• תת-יחידות קטליטיות משתחררות ומזרחנות מצעים

שאלה 4 - השפעות PKA

פעילות יתר של PKA תגרום ל-?

1. רמות גבוהות של גלוקוז בדם
2. ביטוי גנים
3. רמות גבוהות של חומצות שומן בדם
4. כל התשובות נכונות

פתרון

תשובה: 4 (כל התשובות נכונות)

הסבר:

• ✅ גלוקוז: PKA מפעיל glycogen phosphorylase ← פירוק גליקוגן ← גלוקוז
• ✅ ביטוי גנים: PKA מזרחן CREB ← שעתוק גנים
• ✅ חומצות שומן: PKA מפעיל hormone-sensitive lipase ← ליפוליזה

שאלה 5 - PKC

שתי מוטציות באנזים PKC באתרים שקושרים סידן ו-DAG יגרמו ל-?

1. חוסר פעילות של PKC
2. עודף פעילות של PKC
3. המוטציות לא ישפיעו על הפעילות
4. אין מספיק נתונים

פתרון

תשובה: 4 (אין מספיק נתונים)

הסבר: לא נאמר מה סוג המוטציות:

• מוטציות Loss-of-function ← חוסר פעילות
• מוטציות Gain-of-function (constitutively active) ← עודף פעילות
• ללא מידע על טיב המוטציה, אי אפשר לקבוע

שאלה 6 - Transducin

הפעלה של $\mathrm{G_t \, protein}$ תגרום ל-?

1. עליה בריכוז של DAG וסידן
2. עליה בריכוז של cAMP
3. הפעלה של PDE שמוריד את ריכוז ה-cAMP
4. ירידה בריכוז הסידן בתוך התא

פתרון

תשובה: 4 (ירידה בריכוז הסידן בתוך התא)

הסבר:

• $\mathrm{G_t \, (Transducin)}$ מפעיל cGMP-PDE
• PDE מפרק cGMP
• ירידה ב-cGMP ← סגירת תעלות cGMP-gated
• תעלות אלה מעבירות $\ce{Na^{+}}$ ← ו-$\ce{Ca^{2+}}$
• סגירתן ← ירידה בכניסת $\ce{Ca^{2+}}$ ← ירידה בריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ הציטוזולי

שאלה 7 - מסלול אינסולין

איזה מהחלבונים הבאים משמש כ-GEF במסלול של אינסולין?

1. Grb2
2. SOS
3. Raf-1
4. IRS-1

פתרון

תשובה: 2 (SOS)

הסבר:

• SOS = Son of Sevenless
• SOS הוא GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) עבור Ras
• גורם להחלפת GDP ב-GTP על Ras ← הפעלת Ras

שאלה 8 - מקרה קליני: רצפטור $\beta$-אדרנרגי

גבר בן 32 פונה לרופא עם:

• עייפות כרונית
• ירידה בלחץ הדם
• קושי בריכוז
• ירידה בלחץ הדם בעמידה
• ריכוז נמוך של גלוקוז
• ירידה ברמות קורטיזול

איזה מנגנון נפגע?

1. ירידה בתעלות cGMP-gated בפוטורצפטורים
2. עיכוב בזרחון של חלבוני מטרה על ידי MAP-kinase
3. ירידה בזרחון טירוזין של הרצפטור לאחר קישור ל-ligand
4. חוסר הפעלה של חלבון Gs והפחתת רמות cAMP בתא

שאלה 9 - מקרה קליני: ראיית לילה

נער בן 16 עם קושי בראייה בחושך, תפקוד לקוי של תאי Rods. איזה מנגנון נפגע?

1. הפעלה של adenylate cyclase דרך חלבון Gs
2. זרחון של שיירי טירוזין על רצפטור אינסולין
3. עלייה ברמות cAMP לאחר קישור לאדרנלין
4. פירוק של cGMP על ידי פוספודיאסטראז לאחר הפעלת rhodopsin

סיכום: השוואה בין מסלולי GPCR