שיעור 14 סיליות ו-Nodal בציר ימין-שמאל

סיכום ביניים: מה כבר נבנה בציר ימין-שמאל

השיעור ממשיך את ציר ימין-שמאל. עד עתה נבנו כמה רכיבים של המערכת:

• Nodal משתתף בקביעת הצד השמאלי של העובר.
• Lefty1 ו־Lefty2 משתתפים ביצירת מחסום בקו האמצע ובתחימת הביטוי של הסיגנל השמאלי.
• Nodal Flow הוא הזרם שנוצר באזור ה־Node ומתחיל את שבירת הסימטריה.
• פגיעה במנגנון יוצרת Left-Right axis defects או Laterality defects.

בשלב מוקדם, הביטוי של Nodal סביב ה־Node יחסית סימטרי. אחר כך הביטוי סביב ה־Node נעשה חזק יותר בצד שמאל, ובהמשך מופיע ביטוי של Nodal ב־left LPM. מתוך הביטוי הזה מופעלים גם Lefty2 ו־Pitx2 בצד שמאל.

המערכת עובדת בשלושה שלבים כלליים:

1. שבירת סימטריה מקומית סביב ה־Node.
2. העברת הא-סימטריה אל ה־left LPM.
3. ייצוב הדפוס כך שהביטוי נשאר בצד שמאל ולא מתפשט לצד ימין.

בשיעור הנוכחי נתמקד בשני חלקים של המנגנון: איך הזרם ב־Node נקרא על ידי התאים, ואיך שינוי קטן סביב ה־Node הופך לביטוי ברור בצד שמאל של העובר.

מודל שתי הסיליות

מודל שתי הסיליות מסביר איך תנועה פיזיקלית של נוזל בתוך אזור ה־Node מתורגמת לאות מולקולרי בצד שמאל.

ב־Node יש שתי אוכלוסיות תאים:

ה־Pit cells מייצרים את הזרם. ה־Crown cells מתנהגים כמו תאי חישה: ה־primary cilia שלהם עומדות במקום, ולכן הן יכולות לשמש כאנטנות שמזהות את מה שקורה בזרם.

החיבור בין הזרם לבין שבירת הסימטריה נעשה דרך עלייה מקומית ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל של ה־Node.

PKD2 ועליית סידן בצד שמאל של ה־Node

אחד הסימנים הראשונים לתגובה א-סימטרית ב־Node הוא עלייה בריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל. בניסוי משתמשים באינדיקטור פלואורסצנטי לסידן (Fluo3), ורואים אות חזק יותר בצד שמאל של ה־Node (הצבע בתמונה משקף את עוצמת האות, ולא את הצבען).

כדי לקשור את העלייה בסידן למנגנון מולקולרי, נעבור לדבר על תעלות סידן ממשפחת הפוליציסטין (Polycystin). בתוך המשפחה הזו חשוב במיוחד PKD2, תעלת סידן ממשפחת PKD2-related / PC2.

במודל שנבנה בשיעור, התעלה הרלוונטית נמצאת ב־primary cilia של ה־Crown cells, ופועלת יחד עם רכיב ממשפחת PKD1-related, בעיקר PKD1L1. מבנה התעלה הכללי מתואר כהטרוטטרמר, למשל יחס של 1PKD1:3PKD2.

PKD2 knockout

כאשר עושים PKD2 knockout בעכברים מתקבלים פגמים בציר ימין-שמאל.

ב־PKD2 knockout רואים:

• דפוס מגוון של כיוון הלב: תקין, אמצעי (Mesocardia) או ימני (Dextrocardia).
• בריאות, מתקבל Right lung isomerism: שני הצדדים מקבלים מבנה דמוי ריאה ימנית.
• ביטוי Nodal סביב ה־Node עדיין קיים.
• ביטוי Nodal ב־left LPM כבר לא מופיע.
• גם Lefty2/Ebaf לא מופיע בצד שמאל.

הפנוטיפ ממקם את PKD2 בשלב שבו הא-סימטריה המקומית סביב ה־Node מועברת לביטוי השמאלי ב־LPM.

איפה PKD2 נמצא ואיפה הוא פועל

השאלה הבאה נוגעת למיקום: האם PKD2 נמצא בתאים שמייצרים את הזרם, בתאים שקולטים את הזרם, או בשניהם? נקדים ונאמר שהוא נמצא בשניהם.

בניסוי משתמשים בעכברים מסוג Lrd-GFP knock-in. החלבון LRD ‏(Left-Right Dynein) נמצא בסיליות נעות, ולכן GFP מסמן במקרה הזה סיליות נעות. במקביל משתמשים בנוגדן נגד PKD2, כך שניתן יהיה לראות היכן התעלה/חלבון PKD2 נמצא.

התוצאה:

• בחלק מהסיליות יש גם Lrd-GFP וגם PKD2; אזי התאים מכילים סיליות נעות וגם PKD2, אלה הם ה־Pit cells.
• בחלק מהסיליות יש PKD2 בלי Lrd-GFP. אלה סיליות שאינן נעות, באזור ה־Crown cells.

מכאן עולה ש־PKD2 נמצא כאמור בשני סוגי הסיליות. כדי לזהות איפה הפונקציה שלו דרושה, נדרש ניסוי פונקציונלי ולא רק צביעה.

עכברים טרנסגניים וניסויי Rescue

כדי לבדוק איפה PKD2 דרוש, משתמשים ב־rescue experiment. מתחילים מעוּבָּר שהוא PKD2 knockout, ואז מחזירים ביטוי של PKD2 רק באוכלוסיית תאים מוגדרת. אם הביטוי הממוקד מחזיר את הביטוי השמאלי של Nodal/Pitx2, אותו אזור מספיק לפונקציה של PKD2 במנגנון ימין-שמאל.

עכברים טרנסגניים

בעכבר טרנסגני מכניסים לגנום מקטע DNA נוסף, שנקרא transgene. המקטע בדרך כלל כולל:

• Promoter/enhancer שמכתיב איפה הגן יתבטא.
• GOI ‏- Gene of Interest, למשל PKD2.
• לעיתים גם reporter, למשל LacZ, שמאפשר לראות איפה ה־transgene התבטא.

transgene היא אחת הדרכים לביטוי Cre בזמן ניסוי.

ההכנסה נעשית בדרך כלל לזיגוטה, למשל בהזרקה אל הפרונוקלאוס הזכרי, ולאחר מכן מחזירים את הזיגוטות לנקבה פונדקאית. האינטגרציה לגנום היא אקראית, ולכן צריך לבדוק אילו צאצאים קיבלו את ה־transgene, והאם הוא מתבטא במקום הרצוי.

FoxA2-PKD2-IRES-LacZ

ב־transgene הראשון משתמשים בפרומוטור עבור הגן FoxA2, שמתבטא חזק באזור ה־Node וה־midline (ראו אזורים אדומים בתמונה מטה).

המבנה כולל PKD2, אחריו IRES, ואחריו LacZ.

• IRES (מ־Internal Ribosome Entry Site) מאפשר תרגום של שני חלבונים מאותו mRNA באאוקריוטים.
• LacZ מקודד ל־β-galactosidase.
• צביעת X-gal מסמנת את התאים שבהם ה־transgene פעיל.

בגלל שהפרומוטר הוא FoxA2, הביטוי כולל את אזור ה־Node, אך הוא רחב יחסית ואינו מוגבל רק ל־Crown cells.

NDE-PKD2-IRES-LacZ

ב־transgene השני משתמשים ב־Node Distal Enhancer ‏(NDE). זהו enhancer מתוך הלוקוס של Nodal, והוא מכוון ביטוי לאזור שסביב ה־Node, בעיקר ל־Crown cells.

תזכורת: ל־Nodal יש כמה enhancers, כולל Nodal signaling responsive enhancer שנמצא באינטרון. אחר הוא Wnt signaling responsive enhancer, שנמצא במעלה הזרם ביחס ל־promoter. ה־NDE הוא enhancer נוסף, שמכוון ביטוי ל־Crown cells.

השימוש ב־NDE מאפשר לבדוק את התרומה של ה־Crown cells בצורה ממוקדת יותר.

Rescue של PKD2 knockout

המטרה היא לבדוק איפה התעלה נמצאת ברמה הפונקציונאלית (לא הפיזית). ניסוי rescue - מחזירים ביטוי של PKD2 בעובר שהוא PKD2 knockout, כדי לבדוק אם הביטוי הממוקד מחזיר את הביטוי השמאלי של Nodal/Pitx2.

בניסוי ה־rescue משווים כמה מצבים:

ה־rescue עם NDE-PKD2 מראה ש־PKD2 ב־Crown cells מספיק להפעלת הביטוי השמאלי של Nodal ו־Pitx2. לכן, הפונקציה העיקרית של PKD2 במנגנון הזה נמצאת בתאי ה־Crown cells, כלומר בתאים שקולטים את הזרם.

מיקום PKD2 דווקא ב־Primary Cilia

ה־rescue בעזרת NDE ממקם את PKD2 ב־Crown cells. השאלה הבאה היא האם PKD2 דרוש דווקא בתוך ה־primary cilia של Crown cells.

בתמונה למעלה החלבון PKD2.

כדי לבדוק זאת משתמשים במבנה שבו PKD2 מחובר ל־Venus, חלבון פלואורסצנטי. כך אפשר לראות איפה נמצא החלבון. נבדוק אותו בשתי מוטציות מסוג Left-Right axis defects. מדובר במוטציות נקודתיות ולא knockout, כך שייתכן שהחלבון עדיין פונקציונאלי איתן.

1. E442G (גלוטמט הפך לגליצין בעמדה 442) - מוטציה שמונעת מהחלבון להגיע ל־primary cilia, אך התעלה עצמה תקינה ויכולה להיפתח. נוכל כך להסיק על פנוטיפים שלא קשורים לפונקציה של התעלה. התעלה הזו לא מגיעה ל־Primary cilia.
2. D509V (אספרטט בעמדה 509 הפכה לוולין) - מוטציה שמונעת מהחלבון להגיע ל־primary cilia וגם פוגעת בתפקוד התעלה.

PKD2::Venus תקין

Venus - חלבון פלואורסצנטי שמחובר (fused) ל־PKD2. החיבור מאפשר לראות את מיקום החלבון, אך לא מפריע לפעילותו.

כאשר מבטאים NDE-PKD2::Venus ב־PKD2 knockout:

• PKD2::Venus מתבטא ב־Crown cells.
• החלבון מגיע ל־primary cilia.
• הביטוי השמאלי של Nodal חוזר.

כך יודעים שהאיחוי ל־Venus עדיין פונקציונלי.

מוטציית E442G

במוטציית E442G החלבון נוצר והתעלה יכולה להיפתח (התעלה תקינה), אך החלבון אינו מגיע כראוי ל־primary cilia.

התוצאה בעובר:

• PKD2(E442G)::Venus נמצא בתא אך אינו מתרכז בסיליה.
• אין rescue של הביטוי השמאלי של Nodal.

זה ניסוי חשוב כי הוא מפריד בין פעילות התעלה לבין המיקום שלה. גם תעלה שיכולה לפעול אינה מספיקה אם היא לא מגיעה ל־primary cilia.

מוטציית D509V

במוטציית D509V החלבון נוצר, אך התעלה פגומה (התעלה לא נפתחת) וגם השינוע שלה לסיליה נפגע (לא מגיע ל־primary cilia). המוטציה מקבילה למוטציה אנושית הקשורה למחלה.

התוצאה דומה ל־loss of function: מתקבלים פגמים בציר ימין-שמאל ואין rescue תקין.

המסקנה משורת הניסויים: ב־Crown cells, ה־PKD2 צריך להיות ממוקם ב־primary cilia כדי להשתתף בקביעת ציר ימין-שמאל.

איך Nodal Flow מפעיל Crown cells

לאחר שממקמים את PKD2 ב־primary cilia של Crown cells, נשארת שאלת ההפעלה: מה בדיוק ב־Nodal Flow גורם לפתיחת תעלת הסידן?

השיעור מציג שתי השערות:

שתי ההשערות מנסות להסביר את אותו רצף: זרם שמאלה באזור ה־Node ← תגובה בצד שמאל של Crown cells ← עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ ← ביטוי שמאלי של Nodal.

NVPs: השערת chemo-sensor

כדי שסיגנל כימי ינוע עם הזרם ויצטבר בצד שמאל, הוא צריך להיות חלקיק או קומפלקס מספיק גדול (מולקולה קטנה ומסיסה תתפזר מהר, ולא תיצור הבדל יציב בין ימין לשמאל).

ב־Node נצפו חלקיקים קטנים שנקראים NVPs - Nodal Vesicular Parcels. אלה וסיקולות שמופרשות על ידי Pit cells (סוג של אקסוזומים שמופרשים על ידי ה־Pit cells).

במיקרוסקופ אלקטרוני רואים NVPs על פני ה־Node ובקרבת microvilli של Pit cells. הווזיקולות האלה קשורות ל־microvilli; הסיליה היא רכיב אחר במערכת.

כאשר מבודדים NVPs, מסמנים אותם בצבע פלואורסצנטי ומחזירים אותם לאזור ה־Node, רואים שהם נעים עם הזרם לכיוון שמאל. לכן הם יכולים לשמש כנשאים פיזיים של סיגנל כימי.

בתוך NVPs נמצאו מולקולות כמו:

• Sonic Hedgehog (Shh)
• Retinoic acid (RA)

ממצאים אלו תומכים במודל ה־NVPs וביכולת שלהם לנוע עם הזרם. עם זאת, לפי השיעור ולמיטב הבנתי, Shh ו־RA אינם ההסבר הישיר לשבירת הסימטריה באזור ה־Node בעכבר. לכן NVPs נשארים מודל אפשרי להפעלה כימית, אך לא המנגנון הסגור של השיעור.

Cilia deflection: השערת mechano-sensor

בהשערת mechano-sensor, הזרם עצמו מפעיל כוח על ה־primary cilia של ה־Crown cells. הסיליה מתכופפת, והכיפוף מפעיל קומפלקס תעלות סידן שכולל PKD1L1/PKD2.

לפי המודל המכני:

1. Pit cells מייצרים זרם שמאלה.
2. הזרם מכופף primary cilia של Crown cells.
3. הכיפוף מפעיל את קומפלקס PKD1L1/PKD2.
4. נפתחות תעלות סידן.
5. מתקבלת עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל של ה־Node.
6. האות הזה מוביל להפעלה שמאלית של Nodal.

המודל הזה מתאים לניסויים שבהם PKD2 חייב להיות ב־primary cilia. הוא גם מזכיר מערכות אחרות שבהן PKD1/PKD2 חשים זרימת נוזל, למשל באפיתל הכליה.

ביטוי Nodal בצד שמאל תלוי בביטוי Nodal סביב ה־Node

בניסוי נוסף, מחקו את ה־NDE, שכאמור אחראי לביטוי Nodal סביב ה־Node. כאשר נשאר ביטוי חלש סביב ה־Node, עדיין הופיע ביטוי Nodal בצד שמאל; אך בעוברים שבהם הביטוי סביב ה־Node נעלם כמעט לחלוטין, נעלם גם הביטוי ב־Left LPM. מכאן שביטוי Nodal בצד שמאל תלוי בביטויו המוקדם סביב ה־Node.

מה־Node אל ה־Lateral Plate Mesoderm

אחרי שנוצר הבדל סביב ה־Node, הא-סימטריה צריכה להגיע אל ה־left LPM. שם מופיע ביטוי ברור של Nodal, ובהמשך גם Lefty2 ו־Pitx2.

הביטוי של Nodal בצד שמאל מופיע באופן דינמי:

• תחילה יש ביטוי סביב ה־Node.
• בשלבי 3-2 סומיטים, מופיע ביטוי חלש באזור קטן ב־left LPM, סמוך לרמת ה־Node.
• תוך זמן קצר (4 סומיטים - התמונה הימנים העליות) הביטוי מתרחב לאורך הציר האנטריורי-פוסטריורי של ה־left LPM.
• לאחר כמה שעות הביטוי נעלם.

המנגנון צריך להסביר גם את המרחב וגם את הזמן: איך אות שמתחיל סביב ה־Node מגיע ל־LPM, ואיך הביטוי מופיע, מתרחב ונעלם בפרק זמן קצר.

שני מודלים להעברת האות

לפי השיעור, המודל המתאים הוא Nodal gradient. ה־Nodal שמתחיל סביב ה־Node מתפשט לכיוון ה־LPM, ותאים ב־left LPM שמסוגלים להגיב ל־Nodal מפעילים ביטוי של Nodal בעצמם.

Lefty, תזמון, והגבלת הביטוי לצד שמאל

כדי להבין איך הביטוי נשאר בצד שמאל, השתמשו בניסויי הזרקה/טרנספקציה של פלסמידים בעוברים בתרבית.

כאשר מזריקים פלסמיד שמבטא GFP עם פרומוטור גנרי, מתקבל ביטוי מקומי של GFP ללא שינוי בדגם הרגיל של Nodal ו־Lefty1.

כאשר מזריקים פלסמיד שמבטא Nodal בצד ימין בשלב early headfold, מתקבלים שני דברים:

• Nodal מתבטא מלאכותית בצד ימין.
• הביטוי הרגיל של Nodal בצד שמאל מדוכא.

כאשר מבצעים את אותו ניסוי בשלב מאוחר יותר (late headfold), הדיכוי של צד שמאל פחות יעיל.

לכן לתזמון יש חשיבות: המערכת רגישה במיוחד בחלון זמן מוקדם.

בהמשך, רואים ש־Nodal בצד ימין מפעיל גם Lefty2 בצד ימין. Lefty2 הוא מעכב של Nodal, ולכן ביטוי מוקדם שלו בצד ימין יכול לדכא את התפתחות הביטוי בצד שמאל.

ניסוי Lefty1 lof

בניסוי נוסף, כאשר מבטאים Lefty2 בצד ימין, הביטוי של Nodal בצד שמאל מדוכא. ב־Lefty1 knockout, הזרקת Nodal בצד ימין כבר לא מדכאת ביעילות את הביטוי בצד שמאל. לכן Lefty1 בקו האמצע הוא חלק הכרחי מהמחסום שמייצב את ההפרדה בין הצדדים.

הניסויים הללו מכינים את המודל המתמטי של השיעור: מערכת שבה Nodal מפעיל גם את עצמו וגם את Lefty, ו־Lefty מעכב את Nodal בטווח רחוק יותר.

Reaction-Diffusion ו־SELI

Reaction-Diffusion (ה־RD) הוא מודל שמסביר איך הבדל קטן בתחילת הדרך, הופך לדפוס ברור ויציב. בהקשר של ציר ימין-שמאל, ההבדל הקטן נוצר סביב ה־Node, והדפוס היציב הוא ביטוי חזק של Nodal בצד שמאל של ה־LPM.

במודל RD יש שני רכיבים דיפוזיביליים:

תנאי המודל:

• local activation: ה־Nodal מפעיל ביטוי נוסף של Nodal במקום שבו הוא הגיע.
• long-range inhibition: ה־Lefty נע בטווח רחוק יותר ומדכא Nodal באזורים אחרים.
• ה־inhibitor מתפשט הרבה יותר מהר מה־activator.
• התאים בצדדים ובקו האמצע שונים ביכולת הביטוי שלהם.

Responsiveness מול capability

בסימולציה למעלה הצדדים הפוכים, צד שמאל בדרך כלל יהיה בחלקו הימני של המסך.

במודל:

• תאי ה־left/right LPM רספונסיביים ל־Nodal, ומסוגלים לבטא הן Nodal והן-Lefty2.
• גם תאי ה־midline רספונסיביים ל־Nodal, אבל הם מסוגלים לבטא בעיקר Lefty1.

ההבדל הזה מסביר מדוע אותו Nodal גורם לתגובה שונה ברקמות שונות:

• בצד שמאל - הוא מפעיל ביטוי של Nodal ו־Lefty2
• בקו האמצע - הוא מפעיל ביטוי של Lefty1

SELI - Self Enhancement and Lateral Inhibition

שם נוסף למבנה הלוגי של המערכת הוא SELI - Self Enhancement and Lateral Inhibition.

המערכת פועלת כך:

1. Nodal Flow יוצר עודף קטן של Nodal בצד שמאל של ה־Node.
2. Nodal מגיע ל־left LPM לפני שהוא מגיע ל־right LPM.
3. ב־left LPM, ה־Nodal מפעיל ביטוי נוסף של Nodal וגם ביטוי של Lefty2.
4. Nodal שמגיע ל־midline מפעיל שם Lefty1.
5. Lefty1 ו־Lefty2 מתפשטים מהר יותר ומדכאים את Nodal בצד ימין.
6. בצד שמאל מתקבלת אקטיבציה חזקה; בצד ימין מתקבלת אינהיביציה.

כך הבדל קטן שנוצר סביב ה־Node הופך לדפוס חזק: Nodal/Lefty2/Pitx2 בצד שמאל, ובלימת התוכנית בצד ימין.

רצף האירועים המרכזי

1. ב־Node יש Pit cells עם סיליות נעות ו־Crown cells עם סיליות שאינן נעות.
2. Pit cells מייצרים Nodal Flow לכיוון שמאל.
3. Crown cells בצד שמאל מגיבות לזרם דרך primary cilia.
4. קומפלקס PKD1L1/PKD2 ב־primary cilia מאפשר עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל.
5. PKD2 דרוש ב־Crown cells, וניסויי rescue עם NDE-PKD2 מספיקים להחזרת ביטוי שמאלי של Nodal/Pitx2.
6. PKD2 צריך להגיע ל־primary cilia; מוטציה שמונעת את המיקום שלו בסיליה לא מצילה את הפנוטיפ.
7. הזרם יכול להפעיל את Crown cells דרך מודל כימי, כמו NVPs, או דרך מודל מכני, כמו כיפוף הסיליה.
8. הביטוי של Nodal סביב ה־Node מוביל לביטוי Nodal ב־left LPM, כנראה דרך Nodal gradient.
9. ב־left LPM, ה־Nodal מפעיל את עצמו ואת Lefty2.
10. ב־midline, ה־Nodal מפעיל Lefty1.
11. Lefty1 ו־Lefty2 מגבילים את Nodal לצד שמאל באמצעות Reaction-Diffusion / SELI.
12. התוצאה היא דפוס שמאלי ברור שמכוון את תוכנית האורגנוגנזה של האיברים לאורך ציר ימין-שמאל.