שיעור 14 סיליות ו-Nodal בציר ימין-שמאל

סיכום ביניים: מה כבר נבנה בציר ימין-שמאל

השיעור ממשיך את ציר ימין-שמאל. עד עתה נבנו כמה רכיבים של המערכת:

• Nodal משתתף בקביעת הצד השמאלי של העובר.
• Lefty1 ו־Lefty2 משתתפים ביצירת מחסום בקו האמצע ובתחימת הביטוי של הסיגנל השמאלי.
• Nodal Flow הוא הזרם שנוצר באזור ה־Node ומתחיל את שבירת הסימטריה.
• פגיעה במנגנון יוצרת Left-Right axis defects או Laterality defects.

בשלב מוקדם, הביטוי של Nodal סביב ה־Node יחסית סימטרי. אחר כך הביטוי סביב ה־Node נעשה חזק יותר בצד שמאל, ובהמשך מופיע ביטוי של Nodal ב־left lateral plate mesoderm. מתוך הביטוי הזה מופעלים גם Lefty2 ו־Pitx2 בצד שמאל.

המערכת עובדת בשלושה שלבים כלליים:

1. שבירת סימטריה מקומית סביב ה־Node.
2. העברת הא-סימטריה אל ה־left lateral plate mesoderm.
3. ייצוב הדפוס כך שהביטוי נשאר בצד שמאל ולא מתפשט לצד ימין.

בשיעור הנוכחי נתמקד בשני חלקים של המנגנון: איך הזרם ב־Node נקרא על ידי התאים, ואיך שינוי קטן סביב ה־Node הופך לביטוי ברור בצד שמאל של העובר.

מודל שתי הסיליות

מודל שתי הסיליות מסביר איך תנועה פיזיקלית של נוזל בתוך אזור ה־Node מתורגמת לאות מולקולרי בצד שמאל.

ב־Node יש שתי אוכלוסיות תאים:

ה־Pit cells מייצרים את הזרם. ה־Crown cells מתנהגים כמו תאי חישה: ה־primary cilia שלהם עומדות במקום, ולכן הן יכולות לשמש כאנטנות שמזהות את מה שקורה בזרם.

החיבור בין הזרם לבין שבירת הסימטריה נעשה דרך עלייה מקומית ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל של ה־Node.

PKD2 ועליית סידן בצד שמאל של ה־Node

אחד הסימנים הראשונים לתגובה א-סימטרית ב־Node הוא עלייה בריכוז $\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל. בניסוי משתמשים באינדיקטור פלואורסצנטי לסידן (Fluo3), ורואים אות חזק יותר בצד שמאל של ה־Node.

כדי לקשור את העלייה בסידן למנגנון מולקולרי, נעבור לדבר על תעלות סידן ממשפחת הפוליציסטין (Polycystin). בתוך המשפחה הזו חשוב במיוחד PKD2, תעלת סידן ממשפחת PKD2-related / PC2.

במודל שנבנה בשיעור, התעלה הרלוונטית נמצאת ב־primary cilia של Crown cells ופועלת יחד עם רכיב ממשפחת PKD1-related, בעיקר PKD1L1. המבנה הכללי של התעלה מתואר כהטרוטטרמר, למשל יחס של 1PKD1:3PKD2.

Pkd2 knockout

כאשר עושים Pkd2 knockout בעכברים מתקבלים פגמים בציר ימין-שמאל.

ב־Pkd2 knockout רואים:

• כיוון הלב יכול להיות תקין, אמצעי (Mesocardia) או ימני (Dextrocardia).
• בריאות מתקבל Right lung isomerism: שני הצדדים מקבלים מבנה דמוי ריאה ימנית.
• ביטוי Nodal סביב ה־Node עדיין קיים.
• ביטוי Nodal ב־left lateral plate mesoderm לא מופיע.
• גם Lefty2/Ebaf לא מופיע בצד שמאל.

הפנוטיפ ממקם את PKD2 בשלב שבו הא-סימטריה המקומית סביב ה־Node מועברת אל הביטוי השמאלי ב־LPM.

איפה PKD2 נמצא ואיפה הוא פועל

השאלה הבאה היא שאלת מיקום: האם PKD2 נמצא בתאים שמייצרים את הזרם, בתאים שקולטים את הזרם, או בשניהם? נקדים ונאמר שהוא נמצא בשניהם.

בניסוי משתמשים בעכברים מסוג Lrd-GFP knock-in. החלבון LRD נמצא בסיליות נעות, ולכן GFP מסמן סיליות נעות. במקביל משתמשים בנוגדן נגד PKD2.

התוצאה:

• בחלק מהסיליות יש גם Lrd-GFP וגם PKD2. אלה סיליות נעות של Pit cells.
• בחלק מהסיליות יש PKD2 בלי Lrd-GFP. אלה סיליות שאינן נעות, באזור ה־Crown cells.

מכאן עולה ש־PKD2 נמצא כאמור בשני סוגי הסיליות. כדי לזהות איפה הפונקציה שלו דרושה, נדרש ניסוי פונקציונלי ולא רק צביעה.

עכברים טרנסגניים וניסויי Rescue

כדי לבדוק איפה PKD2 דרוש, משתמשים ב־rescue experiment. מתחילים מעובר שהוא Pkd2 knockout, ואז מחזירים ביטוי של Pkd2 רק באוכלוסיית תאים מוגדרת. אם הביטוי הממוקד מחזיר את הביטוי השמאלי של Nodal/Pitx2, אותו אזור מספיק לפונקציה של PKD2 במנגנון ימין-שמאל.

עכברים טרנסגניים

בעכבר טרנסגני מכניסים לגנום מקטע DNA נוסף, שנקרא transgene. המקטע בדרך כלל כולל:

• Promoter / enhancer שמכתיב איפה הגן יתבטא.
• GOI - Gene of Interest, למשל Pkd2.
• לעיתים גם reporter, למשל LacZ, שמאפשר לראות איפה ה־transgene התבטא.

ההכנסה נעשית בדרך כלל לזיגוטה, למשל בהזרקה אל הפרונוקלאוס הזכרי, ולאחר מכן מחזירים את הזיגוטות לנקבה פונדקאית. האינטגרציה לגנום היא אקראית, ולכן צריך לבדוק אילו צאצאים קיבלו את ה־transgene והאם הוא מתבטא במקום הרצוי.

FoxA2-Pkd2-IRES-LacZ

ב־transgene הראשון משתמשים ב־promoter של FoxA2. ה־FoxA2 מתבטא חזק באזור ה־Node וה־midline.

ה־construct כולל Pkd2, אחריו IRES, ואחריו LacZ.

• IRES מאפשר תרגום של שני חלבונים מאותו mRNA ביוקריוטים.
• LacZ מקודד ל־β-galactosidase.
• צביעת X-gal מסמנת את התאים שבהם ה־transgene פעיל.

בגלל שה־promoter הוא FoxA2, הביטוי כולל את אזור ה־Node, אך הוא רחב יחסית ואינו מוגבל רק ל־Crown cells.

NDE-Pkd2-IRES-LacZ

ב־transgene השני משתמשים ב־NDE - Node Distal Enhancer. זה enhancer מתוך הלוקוס של Nodal, והוא מכוון ביטוי לאזור שסביב ה־Node, בעיקר ל־Crown cells.

השימוש ב־NDE מאפשר לבדוק את התרומה של Crown cells בצורה ממוקדת יותר.

Rescue של Pkd2 knockout

בניסוי ה־rescue משווים כמה מצבים:

ה־rescue עם NDE-Pkd2 מראה ש־PKD2 ב־Crown cells מספיק להפעלת הביטוי השמאלי של Nodal ו־Pitx2. לכן, הפונקציה העיקרית של PKD2 במנגנון הזה נמצאת בתאי ה־Crown cells, כלומר בתאים שקולטים את הזרם.

מיקום PKD2 ב־primary cilia

ה־rescue בעזרת NDE ממקם את PKD2 ב־Crown cells. השאלה הבאה היא האם PKD2 דרוש דווקא בתוך ה־primary cilia של Crown cells.

כדי לבדוק זאת משתמשים ב־construct שבו Pkd2 מחובר ל־Venus, חלבון פלואורסצנטי. כך אפשר לראות איפה נמצא החלבון.

Pkd2::Venus תקין

כאשר מבטאים NDE-Pkd2::Venus ב־Pkd2 knockout:

• Pkd2::Venus מתבטא ב־Crown cells.
• החלבון מגיע ל־primary cilia.
• הביטוי השמאלי של Nodal חוזר.

כך יודעים שהאיחוי ל־Venus עדיין פונקציונלי.

מוטציית E442G

במוטציית E442G החלבון נוצר והתעלה יכולה להיפתח, אך החלבון אינו מגיע כראוי ל־primary cilia.

התוצאה בעובר:

• Pkd2(E442G)::Venus נמצא בתא אך אינו מתרכז בסיליה.
• אין rescue של הביטוי השמאלי של Nodal.

זה ניסוי חשוב כי הוא מפריד בין פעילות התעלה לבין המיקום שלה. גם תעלה שיכולה לפעול אינה מספיקה אם היא לא מגיעה ל־primary cilia.

מוטציית D509V

במוטציית D509V החלבון נוצר, אך התעלה פגומה וגם ה־trafficking שלה לסיליה נפגע. המוטציה מקבילה למוטציה אנושית הקשורה למחלה.

התוצאה דומה ל־loss of function: מתקבלים פגמים בציר ימין-שמאל ואין rescue תקין.

המסקנה משורת הניסויים הזו: ב־Crown cells, ה־PKD2 אכן צריך להיות ממוקם ב־primary cilia כדי להשתתף בקביעת ציר ימין-שמאל.

איך Nodal Flow מפעיל את Crown cells

לאחר שממקמים את PKD2 ב־primary cilia של Crown cells, נשארת שאלת ההפעלה: מה בדיוק ב־Nodal Flow גורם לפתיחת תעלת הסידן?

השיעור מציג שתי השערות:

שתי ההשערות מנסות להסביר את אותו רצף: זרם שמאלה באזור ה־Node ← תגובה בצד שמאל של Crown cells ← עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ ← ביטוי שמאלי של Nodal.

NVPs: השערת chemo-sensor

כדי שסיגנל כימי ינוע עם הזרם ויצטבר בצד שמאל, הוא צריך להיות חלקיק או קומפלקס מספיק גדול (מולקולה קטנה ומסיסה תתפזר מהר ולא תיצור הבדל יציב בין ימין לשמאל).

ב־Node נצפו חלקיקים קטנים שנקראים NVPs - Nodal Vesicular Parcels. אלה וסיקולות שמופרשות על ידי Pit cells.

במיקרוסקופ אלקטרוני רואים NVPs על פני ה־Node ובקרבת microvilli של Pit cells. ה־vesicles האלה קשורות ל־microvilli; הסיליה היא רכיב אחר במערכת.

כאשר מבודדים NVPs, מסמנים אותם בצבע פלואורסצנטי ומחזירים אותם לאזור ה־Node, רואים שהם נעים עם הזרם לכיוון שמאל. לכן הם יכולים לשמש כנשאים פיזיים של סיגנל כימי.

בתוך NVPs נמצאו מולקולות כמו:

• Sonic Hedgehog (Shh)
• Retinoic acid (RA)

ממצאים אלו תומכים במודל ה־NVPs וביכולת שלהם לנוע עם הזרם. עם זאת, לפי השיעור Shh ו־RA אינם ההסבר הישיר לשבירת הסימטריה באזור ה־Node בעכבר. לכן NVPs נשארים מודל אפשרי להפעלה כימית, אך לא המנגנון הסגור של השיעור.

Cilia deflection: השערת mechano-sensor

בהשערת mechano-sensor, הזרם עצמו מפעיל כוח על ה־primary cilia של ה־Crown cells. הסיליה מתכופפת, והכיפוף מפעיל קומפלקס תעלות סידן שכולל PKD1L1/PKD2.

הרצף לפי המודל המכני:

1. Pit cells מייצרים זרם שמאלה.
2. הזרם מכופף primary cilia של Crown cells.
3. הכיפוף מפעיל את קומפלקס PKD1L1/PKD2.
4. נפתחות תעלות סידן.
5. מתקבלת עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל של ה־Node.
6. האות הזה מוביל להפעלה שמאלית של Nodal.

המודל הזה מתאים לניסויים שבהם PKD2 חייב להיות ב־primary cilia. הוא גם מזכיר מערכות אחרות שבהן PKD1/PKD2 חשים זרימת נוזל, למשל באפיתל הכליה.

מה־Node אל ה־Lateral Plate Mesoderm

אחרי שנוצר הבדל סביב ה־Node, הא-סימטריה צריכה להגיע אל ה־left lateral plate mesoderm. שם מופיע ביטוי ברור של Nodal, ובהמשך גם Lefty2 ו־Pitx2.

הביטוי של Nodal בצד שמאל מופיע באופן דינמי:

• בתחילה יש ביטוי סביב ה־Node.
• בשלבי 3-2 סומיטים מופיע ביטוי חלש באזור קטן ב־left LPM, סמוך לרמת ה־Node.
• תוך זמן קצר הביטוי מתרחב לאורך הציר האנטריורי-פוסטריורי של ה־left LPM.
• לאחר כמה שעות הביטוי נעלם.

המנגנון צריך להסביר גם את המרחב וגם את הזמן: איך אות שמתחיל סביב ה־Node מגיע ל־LPM, ואיך הביטוי מופיע, מתרחב ונעלם בפרק זמן קצר.

שני מודלים להעברת האות

לפי השיעור, המודל המתאים הוא Nodal gradient. ה־Nodal שמתחיל סביב ה־Node מתפשט לכיוון ה־LPM, ותאים ב־left LPM שמסוגלים להגיב ל־Nodal מפעילים ביטוי של Nodal בעצמם.

Lefty, תזמון והגבלת הביטוי לצד שמאל

כדי להבין איך הביטוי נשאר בצד שמאל, השתמשו בניסויי הזרקה/טרנספקציה של פלסמידים בעוברים בתרבית.

כאשר מזריקים פלסמיד שמבטא GFP, מתקבל ביטוי מקומי של GFP ללא שינוי בדגם הרגיל של Nodal ו־Lefty1.

כאשר מזריקים פלסמיד שמבטא Nodal בצד ימין בשלב early headfold, מתקבלים שני דברים:

• Nodal מתבטא מלאכותית בצד ימין.
• הביטוי הרגיל של Nodal בצד שמאל מדוכא.

כאשר מבצעים את אותו ניסוי בשלב מאוחר יותר (late headfold), הדיכוי של צד שמאל פחות יעיל. לכן לתזמון יש חשיבות: המערכת רגישה במיוחד בחלון זמן מוקדם.

בהמשך, רואים ש־Nodal בצד ימין מפעיל גם Lefty2 בצד ימין. Lefty2 הוא מעכב של Nodal, ולכן ביטוי מוקדם שלו בצד ימין יכול לדכא את התפתחות הביטוי בצד שמאל.

בניסוי נוסף, כאשר מבטאים Lefty2 בצד ימין, הביטוי של Nodal בצד שמאל מדוכא. ב־Lefty1 knockout, הזרקת Nodal בצד ימין כבר לא מדכאת ביעילות את הביטוי בצד שמאל. לכן Lefty1 בקו האמצע הוא חלק הכרחי מהמחסום שמייצב את ההפרדה בין הצדדים.

הניסויים האלה מכינים את המודל המתמטי של השיעור: מערכת שבה Nodal מפעיל את עצמו ואת Lefty, ו־Lefty מעכב את Nodal בטווח רחוק יותר.

Reaction-Diffusion ו־SELI

Reaction-Diffusion (RD) הוא מודל שמסביר איך הבדל קטן בתחילת הדרך הופך לדפוס ברור ויציב. בהקשר של ציר ימין-שמאל, ההבדל הקטן נוצר סביב ה־Node, והדפוס היציב הוא ביטוי חזק של Nodal בצד שמאל של ה־LPM.

במודל RD יש שני רכיבים דיפוזיביליים:

התנאים של המודל:

• יש local activation: ה־Nodal מפעיל ביטוי נוסף של Nodal במקום שבו הוא הגיע.
• יש long-range inhibition: ה־Lefty נע בטווח רחוק יותר ומדכא Nodal באזורים אחרים.
• ה־inhibitor מתפשט מהר יותר מה־activator.
• התאים בצדדים ובקו האמצע שונים ביכולת הביטוי שלהם.

Responsiveness מול capability

במודל:

• תאי ה־left/right LPM רספונסיבים גם ל־Nodal וגם מסוגלים לבטא הן Nodal והן-Lefty2.
• תאי ה־midline רספונסיבים ל־Nodal, אבל מסוגלים לבטא בעיקר Lefty1.

ההבדל הזה מסביר מדוע אותו Nodal גורם לתגובה שונה ברקמות שונות: הוא מפעיל ביטוי של Nodal ו־Lefty2 בצד שמאל, ומפעיל ביטוי של Lefty1 בקו האמצע.

SELI - Self Enhancement and Lateral Inhibition

שם נוסף למבנה הלוגי של המערכת הוא SELI - Self Enhancement and Lateral Inhibition.

המערכת פועלת כך:

1. Nodal Flow יוצר עודף קטן של Nodal בצד שמאל של ה־Node.
2. Nodal מגיע ל־left LPM לפני שהוא מגיע ל־right LPM.
3. ב־left LPM, Nodal מפעיל ביטוי נוסף של Nodal וגם ביטוי של Lefty2.
4. Nodal שמגיע ל־midline מפעיל שם Lefty1.
5. Lefty1 ו־Lefty2 מתפשטים מהר יותר ומדכאים את Nodal בצד ימין.
6. בצד שמאל מתקבלת אקטיבציה חזקה; בצד ימין מתקבלת אינהיביציה.

כך הבדל קטן שנוצר סביב ה־Node הופך לדפוס חזק: Nodal/Lefty2/Pitx2 בצד שמאל, ובלימה של התוכנית הזו בצד ימין.

רצף האירועים המרכזי

1. ב־Node יש Pit cells עם סיליות נעות ו־Crown cells עם סיליות שאינן נעות.
2. Pit cells מייצרים Nodal Flow לכיוון שמאל.
3. Crown cells בצד שמאל מגיבות לזרם דרך primary cilia.
4. קומפלקס PKD1L1/PKD2 ב־primary cilia מאפשר עלייה ב־$\ce{Ca^{2+}}$ בצד שמאל.
5. PKD2 דרוש ב־Crown cells, וניסויי rescue עם NDE-Pkd2 מספיקים להחזרת ביטוי שמאלי של Nodal/Pitx2.
6. PKD2 צריך להגיע ל־primary cilia; מוטציה שמונעת את המיקום שלו בסיליה לא מצילה את הפנוטיפ.
7. הזרם יכול להפעיל את Crown cells דרך מודל כימי, כמו NVPs, או דרך מודל מכני, כמו כיפוף הסיליה.
8. הביטוי של Nodal סביב ה־Node מוביל לביטוי Nodal ב־left LPM, כנראה דרך Nodal gradient.
9. ב־left LPM, Nodal מפעיל את עצמו ואת Lefty2.
10. ב־midline, Nodal מפעיל Lefty1.
11. Lefty1 ו־Lefty2 מגבילים את Nodal לצד שמאל באמצעות Reaction-Diffusion / SELI.
12. התוצאה היא דפוס שמאלי ברור שמכוון את תוכנית האורגנוגנזה של האיברים לאורך ציר ימין-שמאל.