שיעור 14 V(D)J recombination, ‏RAG והיפרמוטציה סומטית

חזרה קצרה - שברי DNA ומנגנוני תיקון

השיעור נפתח בחזרה על הנושאים של שיעור 13: תיקון שברים דו־גדיליים, ATM, ‏BRCA, ‏PARP inhibitors ושיטות לזיהוי שברי DNA.

הנקודות החשובות:

• פגם בחלבוני Ku יפגע בעיקר בתיקון שברים דו־גדיליים בשלב G1, כי בשלב הזה אין כרומטידה אחות זמינה ולכן התא תלוי ב־NHEJ.
• מעכבי PARP גורמים לרמות גבוהות של נזקי DNA, אבל הם לא מעלים ישירות את פעילות HR. הקשר ל־HR הוא שהנזקים שהם יוצרים צריכים להיות מתוקנים על ידי HR.
• טיפול במעכבי PARP יעיל במיוחד בתאים עם פגם ב־BRCA1/2 בגלל synthetic lethality: שילוב של יצירת נזקים וחוסר יכולת לתקן אותם.
• פגם ב־ATM גורם לרגישות לקרינה מייננת, כי התא לא מאותת נכון על שברים דו־גדיליים.
• פגם ב־Ligase IV יכול להסביר חוסר בתאי B ו־T, כי Ligase IV חיוני ל־NHEJ, ו־NHEJ חיוני ליצירת מערכת החיסון הנרכשת.
• תנאים שמעודדים HR על פני NHEJ הם שלב S/G2, פעילות BRCA1, ו־end resection.
• Comet assay מבוסס על ג׳ל אלקטרופורזה של DNA צבוע פלואורסצנטית, ולא על נוגדן.
• ב־END-seq, שומרים את ה־DNA בתוך אגרוז, כדי למנוע שברים מכניים בזמן הכנת הספרייה.
• התבנית ב־HR מגיעה מהכרומטידה האחות, לא מהכרומוזום ההומולוגי.
• ATM לא מחבר את קצוות ה־DNA בעצמו; הוא מתאם את תגובת הנזק, כולל פוספורילציה של H2AX, בקרת מחזור התא והכוונת בחירת מסלול התיקון.
• 53BP1 מקדם חסימת resection ולכן דוחף לכיוון NHEJ.
• BRCA-ness מתאר מצב של חסר ב־HR בלי מוטציה ישירה ב־BRCA.

מכאן ממשיכים לנושא של השיעור: נזקי DNA שמתרחשים בכוונה, כחלק מתהליכים פיזיולוגיים.

נזקי DNA יזומים במערכת החיסון

בשיעורים הקודמים, שברי DNA תוארו בעיקר כבעיה: נזק שיכול לגרום למוות תאי, אי־יציבות גנומית או סרטן. כאן הזווית משתנה: יש תהליכים שבהם התא יוצר שברי DNA באופן יזום, כדי לבצע פעולה חיונית.

דוגמאות לנזקי DNA יזומים:

• Meiotic recombination - שחלוף בין כרומוזומים הומולוגיים לפני מיוזה, בין השאר בעזרת SPO11.
• Topological stress relaxation - שברים זמניים שנוצרים על ידי טופואיזומראזת כדי לשחרר מתח טופולוגי.
• V(D)J recombination - יצירת רפרטואר ראשוני של נוגדנים וקולטנים בתאים T (T-cell receptors).
• SHM ‏(Somatic Hypermutation) - יצירת מוטציות נקודתיות בנוגדנים כדי לשפר אפיניות לאנטיגן.

בשיעור הנוכחי הדגש הוא על מערכת החיסון הנרכשת. לא ניכנס לאימונולוגיה עצמה, מעבר למה שנדרש כדי להבין את מנגנוני ה־DNA.

שני שלבים ביצירת רפרטואר חיסוני

בתאי B (סוג של תאי דם לבנים המהווים מרכיב מרכזי במערכת החיסו), יש שני שלבים עיקריים שקשורים לגיוון הנוגדנים:

1. יצירה ראשונית של רפרטואר מגוון - לפני חשיפה לאנטיגן. זה נעשה על ידי V(D)J recombination. נוצרים רצפטורים רבים באופן אקראי.

2. שיפור האפיניות לאחר חשיפה לאנטיגן - לאחר שכבר יש נוגדנים שמזהים אנטיגן מסוים, זה נעשה על ידי SHM ו־affinity maturation. נוצרת סלקציה: תאים עם נוגדנים שקושרים טוב יותר את האנטיגן - שורדים ומתרבים יותר.

V(D)J Recombination ו־RAG

בדרך כלל, גן אחד מכיל רצף אחד שמקודד לחלבון אחד. אך בנוגדנים ובקולטנים של תאי T, נדרש שאזור גנטי אחד ייצר מגוון חלבונים. הדבר מתאפשר בזכות מבנה בשם Antigen receptor locus.

בלוקוס הקולטן לאנטיגן (בתרגום חופשי), יש מקטעים מסוגים שונים:

• V
• D
• J

בכל תא, נבחרים מקטעים מסוימים מתוך המאגר ומחוברים יחדיו. השילוב שנוצר מקודד לאזור המשתנה (variable region) של הנוגדן או הרצפטור, והאזור המשתנה הוא זה שקובע את הספציפיות לאנטיגן.

מדובר בעריכה של ה־DNA עצמו, לא של ה־RNA. לכן תאי B או T שעברו רקומבינציה, שונים זה מזה ממש ברמת הגנום.

RAG מבצע את החיתוך

האנזים שמתחיל את התהליך נקרא RAG ‏(Recombination Activating Gene). RAG מזהה רצפים בשם RSS ‏(Recombination Signal Sequences), שנמצאים ליד מקטעי V, D ו־J. ‏RAG חותך סמוך להם, וכך יוצר שברים דו־גדיליים מבוקרים.

לאחר החיתוך הקצוות מחוברת מחדש באמצעות NHEJ.

לכן V(D)J recombination הוא למעשה תהליך של:

cut by RAG → repair/joining by NHEJ

זו גם הסיבה שפגם ב־NHEJ יכול לגרום לכשל חיסוני (immunodeficiency): החיתוך יכול להתרחש, אבל החיבור מחדש נכשל.

איך שולטים ב־Cut and Paste?

האתגר הגדול הוא לשלוט באנזים שיוצר שברי DNA. ‏RAG חייב לחתוך רק באזורים הנכונים, בזמנים הנכונים, ולדאוג שהקצוות יתחברו נכון.

יש כמה שכבות בקרה:

1. חיתוך רק כאשר שני הצדדים נמצאים יחד.
2. Hairpin מגן על הקצוות.
3. גיוס NHEJ מהיר.
4. כלל 12/23.

להלן נפרט.

חיתוך רק כאשר שני הצדדים נמצאים יחד

RAG יוצר paired complex: שני הרצפים שאמורים לעבור רקומבינציה מובאים יחדיו, ורק אז נוצרים השברים. הוא לא אמור לחתוך כל RSS בנפרד, כך קטן הסיכון שקצה DNA אחד יישאר חופשי ויתחבר בטעות לשבר אחר בגנום.

לאחר החיתוך נוצרים שני סוגי קצוות:

• Coding ends - הקצוות שיחוברו ויהפכו לחלק מהרצף המקודד לנוגדן.
• Signal ends - הקצוות של המקטע שנחתך החוצה, לרוב כדנ״א מעגלי.

Hairpin מגן על הקצוות

קצה DNA חופשי הוא מבנה מסוכן, כי הוא יכול להתחבר לקצה לא נכון וליצור טרנסלוקציה. לכן, נוצר ב־coding ends מבנה hairpin. זה סוג של חסימה של הקצה, שמקטינה את הריאקטיביות שלו עד שמנגנון התיקון המתאים יגיע.

במקביל, RAG נשאר קשור ל־signal ends ומגן גם עליהם.

גיוס מהיר של NHEJ

RAG לא רק חותך - הוא גם עוזר לגייס את חלבוני NHEJ, ובפרט את חלבוני Ku, שהם הראשונים שמזהים קצוות DNA בתיקון NHEJ. המטרה היא שהחיבור יקרה מהר, לפני שהקצוות יספיקו להשתתף בתיקון שגוי.

כלל 12/23

יש שני סוגי RSS:

• 12 RSS
• 23 RSS

רקומבינציה תקינה מתרחשת בין RSS מסוגים שונים: 12 עם 23. הכלל הזה מצמצם חיבורים לא רצויים, למשל חיבור בין שני מקטעים מאותו סוג.

בדיקה עצמית: מה השכבות?

RAG כטרנספוזאז שעבר ביות

RAG התפתח מאנזים דמוי Transposase - אנזים שיודע להזיז מקטעי DNA ממקום למקום בגנום. יש דמיון רעיוני בין טרנספוזיציה לבין V(D)J recombination: בשניהם יש זיהוי רצפים, חיתוך DNA וחיבור מחדש.

אבל RAG עבר domestication - ביות אבולוציוני. הוא איבד חלק מהתכונות ההרסניות של transposase והותאם לתפקיד מבוקר במערכת החיסון.

הבדלים מרכזיים בין transposase לבין RAG:

• RAG דורש זיהוי זוגי של שני רצפים, ולא רק רצף יחיד.
• RAG עובד לפי כלל 12/23.
• RAG אינו מבצע טרנספוזיציה מחדש של המקטע למקום אחר בגנום.
• RAG מגייס את מנגנון NHEJ לתיקון הקצוות.
• RAG מגן על הקצוות שנוצרו, כולל יצירת hairpin.

כך אנזים שמקורו במנגנון נייד ומסוכן הפך לכלי מבוקר ליצירת מגוון חיסוני.

הצד המסוכן של RAG

RSS הוא רצף עם חלקים שמורים וחלקים פחות שמורים. בגלל זה קיימים בגנום הרבה רצפים שדומים ל־RSS, שהם אינם אמורים להשתתף ב־V(D)J recombination. רצפים כאלה נקראים cRSS ‏(cryptic Recombination Signal Sequences).

בדיקה עצמית: מה זה cRSS?

הבעיה: אם RAG מזהה בטעות שני cRSSs, הוא עלול לחתוך אזור שלא אמור להיחתך. אם שני רצפים כאלה נמצאים סביב גן tumor suppressor, התוצאה יכולה להיות מחיקת הגן. זהו אחד ההסברים לפוטנציאל הסרטני של RAG, בעיקר בסרטנים לימפואידיים.

למה זה לא קורה כל הזמן?

אם יש הרבה cRSS, למה RAG לא יוצר נזק בכל הגנום? התשובה היא שיש שכבות נוספות של ספציפיות: RAG לא מסתמך רק על רצף RSS, הוא מגויס בעדיפות לאזורים מסוימים בכרומטין.

אחד הסמנים החשובים הוא H3K4me3 - טרימתילציה של ליזין 4 בהיסטון H3. הסמן הזה מופיע בפרומוטורים, והוא עשיר במיוחד באזורי recombination center בלוקוסים של antigen receptors.

RAG, ובפרט RAG2, נקשר לאזורים עם H3K4me3. לכן כדי ש־RAG יפעל ביעילות, לא מספיק שיהיה רצף דומה ל־RSS; צריך גם סביבה כרומטינית מתאימה.

ועדיין, זה לא מסביר את כל הספציפיות. יש אזורים בגנום שיש בהם גם רצפים דמויי RSS וגם סימנים כרומטיניים מתאימים, ובכל זאת כמעט אין בהם חיתוך. כלומר, קיימים כנראה רכיבי בקרה נוספים.

במדידות של קישור RAG מול שברים שנוצרים בפועל, רואים ש־RAG יכול להיקשר להרבה מקומות, אבל חיתוך משמעותי קורה בעיקר בלוקוסים הנכונים. כלומר, קישור כשלעצמו אינו מספיק; צריך תנאים נוספים כדי שהאתר יעבור רקומבינציה.

RAG ולוקמיות

כאשר RAG פעיל מדי או מבוטא בזמן לא נכון, עולה הסיכון לחיתוכים לא רצויים. דוגמה שנדונה היא B-ALL ‏(B-cell acute lymphoblastic leukemia) עם רקע גנטי של ETV6-RUNX1. ברקע כזה RAG יכול להיות פעיל מדי, ואז מחיקות גנטיות רבות מופיעות ליד רצפים שדומים ל־RSS. כלומר, חלק מהשינויים הגנטיים בלוקמיות כאלה יכולים לנבוע מפעילות RAG מחוץ למקום הרצוי.

SHM ו־AID

לאחר V(D)J recombination, כבר יש רפרטואר גדול של תאי B, וכל תא מבטא נוגדן אחר. השלב הבא הוא affinity maturation: שיפור האפיניות של נוגדן לאנטיגן מסוים לאחר חשיפה אליו.

השלב הזה מתרחש בתאי B, לא בתאי T.

• AID ו־SHM רלוונטיים רק לתאי B.
• SHM - רק לתא B שנחשף לאנטיגן (activated), ולא לכל תא B.

במסגרת התהליך, נוצרים שינויים נקודתיים באזורי האימונוגלובולינים. חלק מהמוטציות פוגעות בקישור, חלק לא משנות הרבה, וחלק משפרות את הקישור לאנטיגן. תאים שבהם הנוגדן השתפר שורדים ומתרבים יותר.

זה הבסיס לזיכרון חיסוני: בפעם הבאה שהגוף יפגוש את אותו אנטיגן, כבר יהיו תאים עם נוגדנים טובים יותר.

AID מתחיל את התהליך

האנזים המרכזי הוא AID ‏(Activation-Induced Deaminase), והוא עושה דה־אמינציה של ציטוזין:

AID מעדיף DNA חד־גדילי, לכן הוא פועל בעיקר באזורים שעוברים שעתוק, בהם הגדילים נפתחים לזמן קצר.

בניגוד ל־RAG, ל־AID אין רצף זיהוי חד וברור כמו RSS. יש לו העדפה חלשה לקונטקסטים מסוימים, למשל למוטיב שנקרא WRCY, אבל זו אינה ספציפיות חזקה. לכן השאלה המרכזית היא: איך AID גורם למוטציות בעיקר באימונוגלובולינים ולא בכל הגנום.

איך דה־אמינציה הופכת למוטציה?

דה־אמינציה בפני עצמה אינה בהכרח מוטציה קבועה. היא הופכת למוטציה כאשר התא משכפל או מתקן את האזור בצורה שמקבעת שינוי ברצף.

יש שלוש דרכים עיקריות:

1. שכפול מעל U - אם C עבר דה־אמינציה ל־U, והשכפול מתרחש לפני תיקון, הפולימראז יכול לקרוא את U כמו בסיס שמזדווג עם A. כך השינוי מתקבע כמוטציה לאחר שכפול.

2. Base Excision Repair עם פולימראזות error-prone - במצב רגיל, BER מתקן דה־אמינציה. אבל ב־SHM, מנגנון התיקון מנוצל ליצירת מוטציות. במקום תיקון נקי ומדויק, מגויסות פולימראזות פחות מדויקות, וכך נוצרת אפשרות להכניס מוטציות בזמן השלמת האזור.

3. Mismatch Repair עם Polymerase η - גם MMR יכול לזהות את ה־U/G mismatch שנוצר לאחר דה־אמינציה. במקרה כזה מוסר מקטע שלם, ולא רק בסיס אחד.

   כאשר המקטע מסונתז מחדש על ידי Polymerase η, יכולות להיכנס מוטציות גם בבסיסים סמוכים. לכן חלק גדול מהמוטציות בתהליך הזה מופיע דווקא ב־A ו־T, ולא רק ב־C.

   זה שימוש חריג במנגנוני תיקון: BER ו־MMR, שבדרך כלל נועדו לשמור על הגנום, מנוצלים כאן כדי ליצור גיוון מכוון.

איך AID נשאר יחסית ספציפי?

בדיקה עצמית: מה זה AID?

AID מסוכן לפחות כמו RAG, אולי אפילו יותר מבחינת הספציפיות. הוא יכול עקרונית לעשות דה־אמינציה בכל C שנחשף כחד־גדילי, ולכן חייבים להבין למה רוב המוטציות מופיעות באימונוגלובולינים ולא בכל גן משועתק.

שעתוק פעיל וחד־גדיליות

AID צריך DNA חד־גדילי. לכן התנאי הראשון הוא שעתוק פעיל (active transcription). אבל שעתוק לא מספיק כשלעצמו - הרי יש הרבה גנים משועתקים שלא עוברים SHM ברמה גבוהה.

מה שמגביר את הסיכוי לפעילות AID:

• שעתוק גבוה.
• Pol II stalling - פולימראז RNA II נתקע או מתקדם לאט, ולכן הגדיל החד־גדילי נשאר חשוף יותר זמן.
• R-loops - ה־RNA שנוצר נשאר מזווג ל־DNA, וכך הגדיל השני נשאר חד־גדילי.

באזורי אימונוגלובולינים יש רמות שעתוק גבוהות, Pol II stalling ו־R-loop formation. כל אלה הופכים אותם לאזורים נוחים יותר לפעילות AID.

הסביבה הגנטית חשובה יותר מרצף הגן

ניסוי חשוב הראה שאם מכניסים רצף בדיקה במקום לוקוס אימונוגלובולין, גם הרצף הזר יכול לעבור מוטציות ברמה גבוהה. המסקנה היא שהספציפיות של SHM תלויה גם בסביבה הגנטית והרגולטורית שבה הגן נמצא, ולא רק ברצף הגן עצמו.

Enhancers של אימונוגלובולינים

אינהנסרים באזורי אימונוגלובולינים חשובים מאוד ל־SHM. כאשר מסירים חלק מהאינהנסרים, רמת המוטציות יורדת. זה אומר שהאינהנסרים לא רק מגבירים שעתוק; הם יוצרים סביבה רגולטורית שמאפשרת פעילות AID וצבירת מוטציות.

עדיין לא ברור לגמרי מהו הקוד המדויק. ייתכן שהאינהנסרים משפיעים על Pol II stalling, על R-loops, על מבנה הכרומטין, או על גיוס עקיף של פקטורים נוספים.

אזורים חמים, DIVAC ומיפוי פעילות AID

לא כל הגנום רגיש באותה מידה ל־AID: יש אזורים ״חמים״ שבהם יש הרבה SHM, ואזורים ״קרים״ שבהם יש מעט מאוד.

בהתחלה אפשר לחשוב שההבדל הוא רק רמת השעתוק, אבל זה לא מספיק - אזורים חמים וקרים יכולים להיות משועתקים ברמה דומה, ובכל זאת לעבור רמות שונות מאוד של מוטציות.

אחד ההבדלים שנמצאו קשור לאינטראקציות עם אינהנסרים: אזורים חמים נוטים להיות באינטראקציה עם הרבה אינהנסרים, בין השאר דרך גורמים שקשורים לארגון הכרומטין ול־loops.

DIVAC

DIVAC ‏(Diversification Activator) הוא מקטע רגולטורי קצר יחסית שמקורו באינהנסרים של אימונוגלובולינים, ויכול לעודד SHM באזור שבו הוא נמצא.

העיקרון מאחורי הניסוי:

1. לוקחים מקטע רגולטורי קטן מאזורי אימונוגלובולינים.
2. מחברים אותו לגן דיווח כמו GFP.
3. מכניסים את המבנה לתאים שמבטאים AID.
4. אם GFP מאבד פעילות, כלומר התאים מפסיקים לזרוח בירוק, זה סימן שנוצרו מוטציות שפגעו ב־GFP.

כך אפשר למדוד אילו מקטעים רגולטוריים מסוגלים להפוך אזור ״קר״ לאזור ״חם״ מבחינת SHM.

מיפוי אזורים חמים בעזרת GFP

גישה נוספת היא להכניס GFP למקומות שונים בגנום בעזרת רטרו־וירוס, בתאים שמבטאים AID, ואז לאסוף תאים שאיבדו את ה־GFP. אם ה־GFP הפסיק לפעול, סביר שהאזור שבו נכנס נוטה לעבור מוטציות. לאחר מכן מרצפים וממפים איפה ה־GFP השתלב. כך ניתן לזהות אזורים חמים וקרים בגנום.

התוצאה הכללית:

• אזורי אימונוגלובולינים הם החמים ביותר.
• יש גם אזורים אחרים בגנום שיכולים להיות חמים יותר מהרגיל.
• אזורים חמים קשורים לאינטראקציות רגולטוריות רבות, בעיקר עם אינהנסרים.

המודל הוא שאזורים עם הרבה אינטראקציות עם אינהנסרים מקבלים באופן מצטבר חלק מהתכונות של DIVAC. הם לא בהכרח מכילים את ה־DIVAC ״המלא״ של אימונוגלובולינים, אבל הם כן יכולים לדמות אותו ברמה מסוימת.

בדיקה עצמית: מה זה DIVAC?

סיכום

השיעור עסק בנזקי DNA יזומים שמשרתים תהליכים פיזיולוגיים, בעיקר במערכת החיסון הנרכשת.

ב־V(D)J recombination, אנזים RAG יוצר שברים דו־גדיליים ליד רצפי RSS, ומנגנון NHEJ מחבר את הקצוות מחדש. כך נוצר מגוון גדול של נוגדנים וקולטני תאי T. ‏RAG מבוקר בכמה שכבות: paired complex, ‏hairpin בקצוות, גיוס מהיר של NHEJ וכלל 12/23.

RAG התפתח מאנזים דמוי transposase שעבר ביות. הוא עדיין מסוכן: אם הוא מזהה cRSS מחוץ ללוקוסים התקינים, הוא יכול לגרום למחיקות או טרנסלוקציות. לכן הפעילות שלו תלויה גם בסביבה כרומטינית כמו H3K4me3, ולא רק ברצף RSS.

בשלב הבא של התפתחות תאי B מתרחש SHM, שמאפשר affinity maturation. האנזים AID עושה דה־אמינציה של C ל־U באזורי אימונוגלובולינים. מנגנוני BER ו־MMR, שבדרך כלל שומרים על הגנום, מנוצלים כאן כדי להפוך את הדה־אמינציה למוטציות.

הספציפיות של AID עדיין לא מוסברת לגמרי. ברור שנדרשים שעתוק פעיל, חד־גדיליות, Pol II stalling ו־R-loops, אבל זה לא מספיק. הסביבה הרגולטורית של לוקוס האימונוגלובולינים, ובעיקר אינהנסרים ומקטעי DIVAC, משחקת תפקיד חשוב ביצירת אזורים חמים ל־SHM.

השורה התחתונה: אותם מנגנונים שמאפשרים גיוון חיסוני הם גם מנגנונים עם פוטנציאל הרסני. RAG ו־AID יוצרים נזקי DNA במכוון, ולכן התא חייב לשלוט בהם בדיוק גבוה של זמן, מקום והקשר כרומטיני.