1. משוואת מיכאליס-מנטן - הגזירה המלאה
1.1 הנחות היסוד
בפיתוח משוואת מיכאליס-מנטן, אנחנו מבססים את הניתוח על מספר הנחות יסוד קריטיות:
הנחה ראשונה: הזנחת הריאקציה ההפוכה
\[k_2 >> k_{-2}\]כלומר, קצב יצירת התוצר גדול בהרבה מקצב הריאקציה ההפוכה (מתוצר לקומפלקס $\ce{ES}$). ההנחה הזאת מוצדקת כשאנחנו מודדים את מהירות הריאקציה ההתחלתית, כשריכוז התוצר הוא כמעט אפסי.
הנחה שנייה: עודף סובסטרט
\[[S] >> [E]_{total}\]ריכוז הסובסטרט תמיד בעודף גדול מאוד ביחס לריכוז האנזים הכולל. משמעות ההנחה הזאת היא שהסובסטרט הוא לא הגורם המגביל בריאקציה.
הנחה שלישית: המצב העמיד (Steady State)
\[\frac{d[ES]}{dt} = 0\]ריכוז הקומפלקס $\ce{ES}$ נשאר קבוע לאורך המדידה. זאת הנחת המצב העמיד - היא שונה משיווי משקל כי היא מתייחסת לרכיב בודד במערכת ולא למערכת כולה.
1.2 גזירת המשוואה
במצב העמיד, קצב היצירה של $\ce{ES}$ שווה לקצב הפירוק שלו:
יצירת $\ce{ES}$:
\[\text{Formation rate} = k_1[E][S]\]פירוק $\ce{ES}$:
\[\text{Breakdown rate} = [k_{-1} + k_2](ES)\]במצב עמיד:
\[k_1[E][S] = [k_{-1} + k_2](ES)\]נגדיר את קבוע מיכאליס-מנטן:
\[K_M = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}\]זהו יחס בין קבועי הקצב של פירוק $\ce{ES}$ (לשני הכיוונים) לקבוע הקצב של יצירת $\ce{ES}$.
מכאן:
\[K_M = \frac{[\text{E}][\text{S}]}{[\text{ES}]}\]כאשר ריכוז האנזים הכולל:
\[[\text{E}]_{total} = [\text{E}] + [\text{ES}]\]נציב ונקבל:
\[[\text{ES}] = \frac{[\text{E}]_{total} \cdot [\text{S}]}{K_M + [\text{S}]}\]המהירות ההתחלתית:
\[V_0 = k_2[ES] = \frac{k_2[\text{E}]_{total} \cdot [\text{S}]}{K_M + [\text{S}]}\]כאשר כל האנזים רווי בסובסטרט:
\[V_{max} = k_2[E]_{total}\]לכן משוואת מיכאליס-מנטן:
\[\boxed{V_0 = \frac{V_{max} \cdot [\text{S}]}{K_M + [\text{S}]}}\]1.3 המשמעות של KM
ההגדרה המתמטית: כאשר $[\text{S}] = K_M$:
\[V_0 = \frac{V_{max} \cdot K_M}{K_M + K_M} = \frac{V_{max}}{2}\]לכן: $K_M$ הוא ריכוז הסובסטרט שבו מהירות הריאקציה היא מחצית המהירות המקסימלית.
מקרה פרטי - אפיניות: כאשר $k_2 « k_{-1}$ (השלב הקובע קצב הוא יצירת התוצר):
\[K_M \approx \frac{k_{-1}}{k_1} = K_d\]במקרה זה בלבד, $K_M$ משקף את האפיניות בין האנזים לסובסטרט.
2. פרמטרים קינטיים חשובים
2.1 מספר התחלופה (Turnover Number)
\[k_{cat} = \frac{V_{max}}{[E]_{total}}\]מספר מולקולות הסובסטרט שאנזים בודד הופך לתוצר ביחידת זמן (בתנאי רוויה).
דוגמאות:
- קרבוניק אנהידרז: $k_{cat} = 600,000 \, s^{-1}$
- ליזוזים: $k_{cat} = 0.5 \, s^{-1}$
2.2 השפעת תנאים סביבתיים
pH: כל אנזים פועל באופן אופטימלי ב-pH מסוים:
- פפסין (קיבה): pH אופטימלי = 2
- גלוקוז-6-פוספטאז (רקמות): pH אופטימלי = 6-7
טמפרטורה: השפעה דרמטית על קצב הריאקציה - אנזים שחותך חלבון ב-3 שעות ב-4°C יבצע את אותה ריאקציה ב-10 דקות ב-25°C.
3. גרף ליינוויבר-בורק
כדי לקבוע במדויק את $V_{max}$ ו-$K_M$ (שלעתים קשה להגיע אליהם ניסויית), משתמשים בלינאריזציה:
\[\boxed{\frac{1}{V_0} = \frac{K_M}{V_{max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}}\]זאת משוואת קו ישר מהצורה $y = ax + b$ כאשר:
- ציר Y: $1/V_0$
- ציר X: $1/[S]$
- שיפוע: $K_M/V_{max}$
- חיתוך עם ציר Y: $1/V_{max}$
- חיתוך עם ציר X: $-1/K_M$
4. איזוזימים - משמעות פיזיולוגית
4.1 הגדרה
איזוזימים הם אנזימים שונים המקטלזים את אותה ריאקציה אך נבדלים ב:
- רצף חומצות אמינו
- ערכי $K_M$
- ערכי $V_{max}$
4.2 דוגמה: מטבוליזם אלכוהול
אצטאלדהיד דהידרוגנז (ALDH):
- איזוזים מיטוכונדריאלי: $K_M$ נמוך - פועל ביעילות בריכוזי אצטאלדהיד נמוכים
- איזוזים ציטופלזמטי: $K_M$ גבוה - נכנס לפעולה רק בריכוזים גבוהים
מוטציה ב-ALDH המיטוכונדריאלי גורמת לתסמונת רגישות לאלכוהול (הסמקה, בחילה, טכיקרדיה).
4.3 דוגמה: הקסוקינאז מול גלוקוקינאז
שניהם מזרחנים גלוקוז ל-גלוקוז-6-פוספט:
הקסוקינאז (רוב הרקמות):
- $K_M = 0.1 \, \text{mM}$
- פועל ביעילות בריכוזי גלוקוז נמוכים
- מבטיח אספקת גלוקוז לתאים
גלוקוקינאז (כבד):
- $K_M = 10 \, \text{mM}$ (גבוה פי 100!)
- פועל רק בריכוזי גלוקוז גבוהים
- מאחסן עודפי גלוקוז כגליקוגן
המשמעות: הכבד “לוקח” גלוקוז רק אחרי שהרקמות החיוניות קיבלו את צרכיהן.
5. עיכוב אנזימים
5.1 עיכוב בלתי הפיך
מעכבים הנקשרים קובלנטית לאנזים ומוציאים אותו מכלל פעולה לצמיתות.
דוגמאות:
DIPF (גז עצבים):
- נקשר קובלנטית לסרין באתר הפעיל של אצטילכולין אסטראז
- משבש העברה עצבית בסינפסות
פניצילין:
- נקשר קובלנטית ל-Glycopeptide Transpeptidase
- מונע יצירת קשרי צילוב בדופן התא החיידקי
- גורם למוות החיידק
5.2 עיכוב הפיך - סוגים
5.2.1 עיכוב תחרותי (Competitive)
המעכב מתחרה עם הסובסטרט על האתר הפעיל.
מאפיינים קינטיים:
- $V_{max}$ לא משתנה (ניתן להתגבר על העיכוב בריכוזי סובסטרט גבוהים)
- $K_M^{apparent} = K_M \cdot \alpha$ כאשר $\alpha = 1 + \frac{[I]}{K_i}$
בגרף ליינוויבר-בורק:
- כל הקווים נחתכים על ציר Y (אותו $1/V_{max}$)
- שיפוע עולה עם ריכוז המעכב
דוגמה: מתוטרקסט - מעכב של דיהידרופולאט רדוקטאז, משמש בכימותרפיה.
5.2.2 עיכוב אל-תחרותי (Uncompetitive)
המעכב נקשר רק לקומפלקס ES, לא לאנזים החופשי.
מאפיינים קינטיים:
- גם $V_{max}$ וגם $K_M$ יורדים באותו יחס
- היחס $V_{max}/K_M$ נשאר קבוע
בגרף ליינוויבר-בורק:
- קווים מקבילים (אותו שיפוע)
- חיתוך שונה עם שני הצירים
5.3 המשוואה הכללית לעיכוב
עבור עיכוב תחרותי:
\[V_0 = \frac{V_{max} \cdot [S]}{\alpha K_M + [S]}\]כאשר $\alpha$ הוא מקדם העיכוב התלוי בריכוז המעכב ובקבוע העיכוב $K_i$.
6. חישוב דוגמה
נתון: ריאקציה אנזימטית עם הנתונים הבאים:
- ב-$[S] = 4×10⁻³ \, \text{M}$: $V = 6×10⁻⁴ \, \text{M/s}$
- ב-$[S] = 4×10⁻² \, \text{M}$: $V = 6×10⁻⁴ \, \text{M/s}$
- ב-$[S] = 4×10⁻¹ \, \text{M}$: $V = 6×10⁻⁴ \, \text{M/s}$
ניתוח: המהירות לא משתנה בין הריכוז השני לשלישי ← הגענו ל-$V_{max} = 6×10⁻⁴ \, \text{M/s}$
חישוב $K_M$:
משתמשים בנתון הראשון ובמשוואת מיכאליס-מנטן:
\[6×10⁻⁴ = \frac{6×10⁻⁴ \cdot 4×10⁻³}{K_M + 4×10⁻³}\]פתרון: $K_M = 5×10⁻⁴ \, \text{M}$
מסקנה: ב-$[S] = 5×10⁻⁴ \, \text{M}$, המהירות תהיה $V_{max}/2 = 3×10⁻⁴ \, \text{M/s}$
7. סיכום
קינטיקה אנזימטית מספקת כלים כמותיים להבנת פעילות אנזימים ולפיתוח תרופות. משוואת מיכאליס-מנטן ונגזרותיה מאפשרות:
- אפיון כמותי של אנזימים ($K_M$, $V_{max}$, $k_{cat}$)
- הבנת מנגנוני עיכוב
- תכנון רציונלי של תרופות
- הבנת המשמעות הפיזיולוגית של איזוזימים
העקרונות הללו הם הבסיס להבנת רגולציה מטבולית ולפיתוח טיפולים תרופתיים רבים.
דור פסקל