1. משוואת מיכאליס-מנטן - הגזירה המלאה
1.1 הנחות היסוד
בפיתוח משוואת מיכאליס-מנטן, אנחנו מבססים את הניתוח על מספר הנחות יסוד קריטיות:
הנחה ראשונה: הזנחת הריאקציה ההפוכה
\[k_2 \gg k_{-2}\]כלומר, קצב יצירת התוצר גדול בהרבה מקצב הריאקציה ההפוכה (מתוצר לקומפלקס $\ce{ES}$). ההנחה הזאת מוצדקת כשאנחנו מודדים את מהירות הריאקציה ההתחלתית, כשריכוז התוצר הוא כמעט אפסי.
הנחה שנייה: עודף סובסטרט
\[\left[ \text{S} \right] \gg \left[ \text{E} \right]_{total}\]ריכוז הסובסטרט תמיד בעודף גדול מאוד ביחס לריכוז האנזים הכולל. משמעות ההנחה הזאת היא שהסובסטרט הוא לא הגורם המגביל בריאקציה.
הנחה שלישית: המצב העמיד (Steady State)
\[\frac{d\left[ \text{ES} \right]}{dt} = 0\]ריכוז הקומפלקס $\ce{ES}$ נשאר קבוע לאורך המדידה. זאת הנחת המצב העמיד - היא שונה משיווי משקל, כי היא מתייחסת לרכיב בודד במערכת ולא למערכת כולה.
1.2 גזירת המשוואה
במצב העמיד, קצב היצירה של $\ce{ES}$ שווה לקצב הפירוק שלו:
יצירת $\ce{ES}$:
\[\text{Formation rate} = k_1\left[ \text{E} \right]\left[ \text{S} \right]\]פירוק $\ce{ES}$:
\[\text{Breakdown rate} = [k_{-1} + k_2](ES)\]במצב עמיד:
\[k_1\left[ \text{E} \right]\left[ \text{S} \right] = [k_{-1} + k_2](ES)\]נגדיר את קבוע מיכאליס-מנטן:
\[K_{\text{m}} = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}\]זהו יחס בין קבועי הקצב של פירוק $\ce{ES}$ (לשני הכיוונים) לקבוע הקצב של יצירת $\ce{ES}$.
מכאן:
\[K_{\text{m}} = \frac{[\text{E}][\text{S}]}{[\text{ES}]}\]כאשר ריכוז האנזים הכולל:
\[[\text{E}]_{total} = [\text{E}] + [\text{ES}]\]נציב ונקבל:
\[[\text{ES}] = \frac{[\text{E}]_{total} \cdot [\text{S}]}{K_{\text{m}} + [\text{S}]}\]המהירות ההתחלתית:
\[V_0 = k_2\left[ \text{ES} \right] = \frac{k_2[\text{E}]_{total} \cdot [\text{S}]}{K_{\text{m}} + [\text{S}]}\]כאשר כל האנזים רווי בסובסטרט:
\[V_{\text{max}} = k_2\left[ \text{E} \right]_{total}\]לכן משוואת מיכאליס-מנטן:
\[\boxed{V_0 = \frac{V_{\text{max}} \cdot [\text{S}]}{K_{\text{m}} + [\text{S}]}}\]1.3 המשמעות של KM
ההגדרה המתמטית: כאשר $[\text{S}] = K_{\text{m}}$:
\[V_0 = \frac{V_{\text{max}} \cdot K_{\text{m}}}{K_{\text{m}} + K_{\text{m}}} = \frac{V_{\text{max}}}{2}\]לכן: $K_{\text{m}}$ הוא ריכוז הסובסטרט שבו מהירות הריאקציה היא מחצית המהירות המקסימלית.
מקרה פרטי - אפיניות: כאשר $k_2 \ll k_{-1}$ (השלב הקובע קצב הוא יצירת התוצר):
\[K_{\text{m}} \approx \frac{k_{-1}}{k_1} = K_d\]במקרה זה בלבד, $K_{\text{m}}$ משקף את האפיניות בין האנזים לסובסטרט.
2. פרמטרים קינטיים חשובים
2.1 מספר התחלופה (Turnover Number)
\[K_{\text{cat}} = \frac{V_{\text{max}}}{\left[ \text{E} \right]_{total}}\]מספר מולקולות הסובסטרט שאנזים בודד הופך לתוצר ביחידת זמן (בתנאי רוויה).
דוגמאות:
- קרבוניק אנהידרז: $K_{\text{cat}} = 600,000 \, \mathrm{s}^{-1}$
- ליזוזים: $K_{\text{cat}} = 0.5 \, \mathrm{s}^{-1}$
2.2 השפעת תנאים סביבתיים
pH: כל אנזים פועל באופן אופטימלי ב-pH מסוים:
- פפסין (קיבה): pH אופטימלי = 2
- גלוקוז-6-פוספטאז (רקמות): pH אופטימלי = 6-7
טמפרטורה: השפעה דרמטית על קצב הריאקציה - אנזים שחותך חלבון ב-3 שעות ב-4°C יבצע את אותה ריאקציה ב-10 דקות ב-25°C.
3. גרף ליינוויבר-בורק
כדי לקבוע במדויק את $V_{\text{max}}$ ו-$K_{\text{m}}$ (שלעתים קשה להגיע אליהם ניסויית), משתמשים בלינאריזציה:
\[\boxed{\frac{1}{V_0} = \frac{K_{\text{m}}}{V_{\text{max}}} \cdot \frac{1}{\left[ \text{S} \right]} + \frac{1}{V_{\text{max}}}}\]זאת משוואת קו ישר מהצורה $y = ax + b$ כאשר:
- ציר Y: $1/V_0$
- ציר X: $1/\left[ \text{S} \right]$
- שיפוע: $K_{\text{m}}/V_{\text{max}}$
- חיתוך עם ציר Y: $1/V_{\text{max}}$
- חיתוך עם ציר X: $-1/K_{\text{m}}$
4. איזוזימים - משמעות פיזיולוגית
4.1 הגדרה
איזוזימים הם אנזימים שונים שמקטלזים את אותה ריאקציה אך נבדלים ב:
- רצף חומצות אמינו
- ערכי $K_{\text{m}}$
- ערכי $V_{\text{max}}$
4.2 דוגמה: מטבוליזם של אלכוהול
אצטאלדהיד דהידרוגנז (ALDH):
- איזוזים מיטוכונדריאלי: $K_{\text{m}}$ נמוך - פועל ביעילות בריכוזי אצטאלדהיד נמוכים
- איזוזים ציטופלזמטי: $K_{\text{m}}$ גבוה - נכנס לפעולה רק בריכוזים גבוהים
מוטציה ב-ALDH המיטוכונדריאלי גורמת לתסמונת רגישות לאלכוהול (הסמקה, בחילה, טכיקרדיה).
4.3 דוגמה: הקסוקינאז מול גלוקוקינאז
שניהם מזרחנים גלוקוז ל-גלוקוז-6-פוספט:
הקסוקינאז (רוב הרקמות):
- $K_{\text{m}} = 0.1 \, \text{mM}$
- פועל ביעילות בריכוזי גלוקוז נמוכים
- מבטיח אספקת גלוקוז לתאים
גלוקוקינאז (כבד):
- $K_{\text{m}} = 10 \, \text{mM}$ (גבוה פי 100!)
- פועל רק בריכוזי גלוקוז גבוהים
- מאחסן עודפי גלוקוז כגליקוגן
המשמעות: הכבד “לוקח” גלוקוז רק אחרי שהרקמות החיוניות קיבלו את צרכיהן.
5. עיכוב אנזימים
5.1 עיכוב בלתי הפיך
מעכבים הנקשרים קובלנטית לאנזים ומוציאים אותו מכלל פעולה לצמיתות.
דוגמאות:
DIPF (גז עצבים):
- נקשר קובלנטית לסרין באתר הפעיל של אצטילכולין אסטראז
- משבש העברה עצבית בסינפסות
פניצילין:
- נקשר קובלנטית ל-Glycopeptide Transpeptidase
- מונע יצירת קשרי צילוב בדופן התא החיידקי
- גורם למוות החיידק
5.2 עיכוב הפיך - סוגים
5.2.1 עיכוב תחרותי (Competitive)
המעכב מתחרה עם הסובסטרט על האתר הפעיל.
מאפיינים קינטיים:
- $V_{\text{max}}$ לא משתנה (ניתן להתגבר על העיכוב בריכוזי סובסטרט גבוהים)
- $K_{\text{m}}^{apparent} = K_{\text{m}} \cdot \alpha$ כאשר $\alpha = 1 + \frac{[I]}{K_i}$
בגרף ליינוויבר-בורק:
- כל הקווים נחתכים על ציר Y (אותו $1/V_{\text{max}}$)
- שיפוע עולה עם ריכוז המעכב
דוגמה: מתוטרקסט - מעכב של דיהידרופולאט רדוקטאז, משמש בכימותרפיה.
5.2.2 עיכוב אל-תחרותי (Uncompetitive)
המעכב נקשר רק לקומפלקס ES, לא לאנזים החופשי.
מאפיינים קינטיים:
- גם $V_{\text{max}}$ וגם $K_{\text{m}}$ יורדים באותו יחס
- היחס $V_{\text{max}}/K_{\text{m}}$ נשאר קבוע
בגרף ליינוויבר-בורק:
- קווים מקבילים (אותו שיפוע)
- חיתוך שונה עם שני הצירים
5.3 המשוואה הכללית לעיכוב
עבור עיכוב תחרותי:
\[V_0 = \frac{V_{\text{max}} \cdot \left[ \text{S} \right]}{\alpha K_{\text{m}} + \left[ \text{S} \right]}\]כאשר $\alpha$ הוא מקדם העיכוב התלוי בריכוז המעכב ובקבוע העיכוב $K_i$.
6. חישוב דוגמה
נתון: ריאקציה אנזימטית שמתנהגת לפי מיכאליס מנטן עם הנתונים הבאים:
$\left[ \text{S} \right] \, (\mathrm{M})$ $V \, (\mathrm{M/s})$ $1\times10^{-4}$ $1\times10^{-4}$ $4\times10^{-3}$ $6\times10^{-4}$ $2\times10^{-3}$ $6\times10^{-4}$ מה יהיו $K_{\text{m}}$ ו-$V$ אם ריכוז הסובסטרט יהיה $5\times 10^{-4} \, \mathrm{M}$?
אפשר ללמוד מהטבלה על המהירות המקסימלית (הוספת ריכוז לא מעלה את המהירות מעבר לה):
\[V_{\text{max}} = 6\times10^{-4} \, (\mathrm{M/s})\]$K_{\text{m}}$ הוא הריכוז שבו המהירות היא בדיוק חצי. נציב במשוואה כדי למצוא אותו:
\[\frac{6\times10^{-4}}{2} = \frac{ 6\times10^{-4} \times 5\times 10^{-4}}{K_{\text{m}} + 5\times 10^{-4}}\] \[K_{\text{m}} + 5\times 10^{-4} = 10 \times 10^{-4}\] \[\boxed{K_{\text{m}} = 5\times 10^{-4}}\]כעת נציב שוב בנוסחה כדי למצוא את המהירות בנתוים ששאלו עליהם:
\[V = \frac{ 6\times10^{-4} \times 5\times 10^{-4}}{ 5\times 10^{-4} + 5\times 10^{-4}} = \boxed{3\times10^{-4}}\]עקרונית היה ניתן להגיע למהירות גם בדרך אחרת - בריכוז של $k_{\text{m}}$ המהירות היא חצי מהמהירות המקסימלית.
7. סיכום
קינטיקה אנזימטית מספקת כלים כמותיים להבנת פעילות אנזימים ולפיתוח תרופות. משוואת מיכאליס-מנטן ונגזרותיה מאפשרות:
- אפיון כמותי של אנזימים ($K_{\text{m}}$, $V_{\text{max}}$, $K_{\text{cat}}$)
- הבנת מנגנוני עיכוב
- תכנון רציונלי של תרופות
- הבנת המשמעות הפיזיולוגית של איזוזימים
העקרונות הללו הם הבסיס להבנת רגולציה מטבולית ולפיתוח טיפולים תרופתיים רבים.
דור פסקל