שיעור 10 המשך גסטרולציה: EMT וקביעת גורלות

פתיחה: מטרת השיעור

בשיעור הקודם תוארה הגסטרולציה בעיקר מבחינה אנטומית: ה־Primitive Streak (PS), יציאת תאים מה־Epiblast, יצירת Mesoderm, כניסת תאים ל־Definitive Endoderm (DE), ובהמשך יצירת Axial mesoderm ו־Notochord.

בשיעור הנוכחי נעבור לשאלות ברמת המנגנון:

1. איך מתבצע EMT ב־PS?
2. איך תאים שונים שיוצאים דרך ה־PS מקבלים גורלות שונים?
3. למה ה־PS מתקדם ברצועה צרה ולא מתפשט לכל הכיוונים?
4. איך הוא נעצר בנקודה הדיסטלית?
5. איך כל זה קשור ל־Snail, FGF, Nodal, BMP, Wnt, Eomes ו־Basal membrane?

Snail, FGF ו־EMT ב־PS

Snail כגורם מרכזי ב־EMT

Snail הוא transcription factor ממשפחת חלבוני zinc finger. הוא פועל בעיקר כרפרסור של שעתוק.

ב־in situ hybridization רואים ש־Snail מתבטא באזור ה־early PS - דפוס ביטוי שמעלה שאלה ישירה: האם Snail משתתף ביצירת ה־PS, ביצירת Mesoderm או בתהליך ה־EMT עצמו?

בניסוי loss of function ל־Snail משווים בין עובר תקין ומוטנט: בעובר התקין, רואים אפיבלסט/אקטודרם, שכבת Mesoderm, שכבה שמתקרבת ל־DE, וגם קרומים כמו Amnion ו־Chorion; במוטנט, ל־Snail העובר קטן יותר, ה־Amnion לא נוצר באופן תקין, ורוב ה־Mesoderm חסר.

בכל זאת, באזור שבו אמור להיווצר ה־PS מופיעה קבוצה קטנה של תאים בין ה־Epiblast לבין ה־Visceral endoderm. כלומר, יש התחלה מסוימת של Ingression ושל יצירת Mesoderm, אבל התהליך חלש ולא ממשיך כרגיל.

הפנוטיפ המרכזי:

בחתכים ובמיקרוסקופ אלקטרונים התאים שיוצאים במוטנט אינם נראים כמו תאים מזנכימליים רגילים. הם מסודרים בשורות, יוצרים חללים קטנים, ומציגים מאפיינים של תאי אפיתל כמו Tight junctions ו־Microvilli.

לכן Snail דרוש ל־EMT תקין. בלעדיו חלק מהתאים יכולים להתחיל לצאת, אבל הם לא מאמצים ולא שומרים על תכונות מזנכימליות.

Snail מדכא E-cadherin

בשלב הבא בודקים את E-cadherin, חלבון מרכזי ב־Adherens junctions של תאי אפיתל.

ב־Wild type, תאי Mesoderm שעברו EMT כמעט לא מבטאים E-cadherin. במוטנט ל־Snail, התאים שיצאו מה־Epiblast עדיין מבטאים E-cadherin ברמת RNA וברמת חלבון.

המודל פשוט:

Snail ─| E-cadherin
E-cadherin ─| EMT

כלומר:

Snail → הורדת E-cadherin → EMT

Snail נקשר לפרומוטור של E-cadherin ומדכא את השעתוק שלו. לכן הרגולציה כאן היא בעיקר ברמת השעתוק.

FGFR1 וניתוח כימרות

גם מוטציה ב־FGFR1 פוגעת בגסטרולציה ויוצרת פנוטיפ דומה בחלקו לפנוטיפ של Snail: תאים מצטברים באזור ה־PS, חלקם יוצאים, אבל הרבה מהם נתקעים ושומרים על מאפיינים אפיתליאליים. מכיוון שמוטציה מלאה ב־FGFR1 קטלנית לעובר, קשה להבין ממנה מה בדיוק קורה בכל תא.

כדי לעקוף זאת משתמשים ב־Chimeric analysis.

הרעיון:

1. מייצרים embryonic stem cells שמסומנים ב־LacZ, כך שאפשר לזהות אותם בצביעה כחולה.
2. חלק מהתאים האלה הם מוטנטים ל־FGFR1.
3. מזריקים אותם לבלסטוציסט תקין.
4. מתקבל עובר כימרי: חלק מהתאים תקינים וחלק מוטנטים.
5. בודקים איפה נמצאים התאים המוטנטים בזמן הגסטרולציה.

היתרון של הניסוי הוא שהעובר כולו לא נעצר מיד, כי יש בו גם תאים תקינים. כך אפשר לראות מה התאים המוטנטים עצמם יודעים לעשות.

התוצאה:

• התאים המוטנטים ל־FGFR1 מגיעים לאזור ה־PS.
• הם נתקעים שם בשיעור גבוה.
• תאים תקינים באותו עובר כן יוצאים ונודדים.
• התופעה היא cell autonomous: הבעיה שייכת לתא המוטנטי עצמו.

המסקנה: FGFR1 דרוש לתאים כדי לצאת בצורה תקינה דרך ה־PS ולהשתלב ב־Mesoderm.

FGF8 הוא הליגנד הרלוונטי באזור ה־PS

FGF8 מתבטא באזור הפוסטריורי של ה־Epiblast, במקום שבו יתחיל ה־PS. במוטנט ל־FGF8 מתקבל פנוטיפ דומה: התפתחות קטנה יותר, הצטברות של תאים באזור ה־PS, ותאים בעלי מאפיינים אפיתליאליים שאינם נודדים כרגיל.

הקשר בין FGF ל־Snail נבדק ישירות באמצעות in situ hybridization ל־Snail במוטנטים ל־FGFR1.

ב־Wild type רואים ביטוי ברור של Snail באזור ה־PS. במוטנט ל־FGFR1 הביטוי של Snail יורד מאוד או נעלם.

לכן המסלול המרכזי הוא:

FGF8
  ↓
FGFR1
  ↓
Snail
  ↓
repression of E-cadherin
  ↓
EMT

או בקיצור:

Fgf8 ───● Fgfr1 ──> Snail
                    │
                    ┴
      EMT ├──── E-cadherin

המסלול הזה חשוב, אבל הוא לא כל הסיפור. EMT כולל עוד מנגנונים: פירוק Basal membrane, שינוי ארגון הציטוסקלטון, שינוי בקשרים בין תאים, ורגולציה נוספת של E-cadherin ברמות שאינן רק שעתוק.

Mesoderm Specification: איך תא מקבל גורל

תאי Mesoderm אינם אוכלוסייה אחת. הם יכולים לתת:

• Extra-embryonic mesoderm
• PGCs
• Lateral plate mesoderm
• Paraxial mesoderm
• Cardiac mesoderm
• Axial mesoderm
• Mesendoderm
• DE

הגורל של תא נקבע לפי שילוב של שני פרמטרים:

אותה נקודה גאוגרפית ב־PS אינה נותנת תמיד אותו גורל. תא שיוצא מוקדם ותא שיוצא מאוחר מאותו אזור יכולים לראות קומבינציות שונות של סיגנלים.

מגרדיאנט Proximal-Distal לגרדיאנט Anterior-Posterior

לפני הגסטרולציה קיימים גרדיאנטים על הציר proximal-distal, בעיקר של Nodal, BMP ו־Wnt.

כאשר ה־DVE נודד והופך ל־AVE, הוא מבטא אנטגוניסטים כמו Cerberus1, Lefty1 ו־DKK1, שדוחקים את הפעילות של Nodal, Wnt ו־BMP לכיוון הפוסטריורי.

כך הציר שהיה קודם לכן proximal-distal מקבל משמעות של anterior-posterior. זו המשמעות המולקולרית של ה־P-D axis rotation: דפוסי הסיגנלינג מתארגנים מחדש כך שהצד הקדמי מדכא אותם, והצד האחורי שומר עליהם.

גם FGF8 נכנס לתמונה בצד הפוסטריורי, ולכן בשלב הזה יש ארבעה גרדיאנטים חשובים לאורך הציר anterior-posterior:

Nodal
BMP
Wnt
FGF

בכל נקודה לאורך ה־PS מתקבלת קומבינציה אחרת של רמות סיגנלינג.

Nodal משנה דפוס בזמן

במהלך התקדמות ה־PS, דפוס הביטוי של Nodal משתנה. בתחילת הדרך הביטוי חזק בצד הפוסטריורי, ובהמשך הגרדיאנט מתהפך.

הנקודה החשובה היא לא רק המיקום, אלא גם הזמן: תא שיוצא מאותה נקודה בשני זמנים שונים יכול לראות רמות אחרות של Nodal. לכן גורל התא תלוי גם בטופוגרפיה וגם בזמן.

Early PS: PGCs מול Extra-embryonic Mesoderm

בשלב Early PS יוצאים בעיקר שני סוגי תאים:

1. Extra-embryonic mesoderm
2. Primordial germ cells (PGCs)

שניהם יוצאים מאזור דומה: ה־posterior proximal epiblast. רוב התאים יהפכו ל־Extra-embryonic mesoderm, ורק קבוצה קטנה, בערך עשרות תאים, תעבור ספציפיקציה ל־PGCs.

Blimp1 / Prdm1 מסמן את קו תאי המין הראשוניים

Blimp1, שנקרא גם Prdm1, הוא transcription factor ממשפחת zinc finger ופועל כרפרסור. הוא חשוב לספציפיקציה הראשונית של PGCs.

במודל שבו GFP מוכנס ללוקוס של Blimp1, כל תא שמבטא Blimp1 מסומן בירוק. רואים Blimp1 ב־Visceral endoderm, אבל בהקשר של PGCs מתמקדים בקבוצה קטנה של תאים ב־Epiblast באזור הפוסטריורי-פרוקסימלי.

בשלבים מתקדמים יותר, תאי PGC נמצאים באזור שמתחת ל־allantoic bud. בהמשך ההתפתחות הם ינדדו דרך אזור ה־hindgut אל הגונדות המתפתחות.

ניסוי קילוף שכבות: מי מונע ומי מאפשר PGCs

כדי להבין למה רק מעט תאים הופכים ל־PGCs, מבצעים ניסויי תרבית בעוברים מוקדמים.

התוצאות העיקריות:

המסקנה:

• Visceral endoderm מפריש גורם שמעכב יצירת PGCs ב־Epiblast.
• Extra-embryonic ectoderm מספק סיגנל שמתגבר על העיכוב הזה באזור הפוסטריורי-פרוקסימלי.
• כך מתקבלת regionalization: רק תאים שנמצאים במקום הנכון יכולים להפוך ל־PGCs.

BMP4, Nodal ו־Blimp1

BMP4 הוא הסיגנל שמאפשר ביטוי של Blimp1 בתאים הקרובים ל־Extra-embryonic ectoderm. במקביל, Nodal גורם ל־Visceral endoderm לייצר גורם מעכב שמונע מתאי Epiblast רבים להפוך ל־PGCs.

Blimp1 מדכא בתא את התוכנית הסומטית, בעיקר תוכנית של Extra-embryonic mesoderm. כך תא שמבטא Blimp1 לא ממשיך למסלול המזודרמלי הרגיל, אלא נשמר במסלול של PGC.

הנקודה שנשארת פתוחה: באותו אזור יש הרבה תאים שנחשפים ל־BMP, אבל רק חלק קטן מהם מבטאים Blimp1 והופכים ל־PGCs. בשיעור לא ניתנה תשובה מלאה לשאלה הזאת.

Cardiac Mesoderm ו־Eomes

כאשר ה־PS מתקדם מעבר לשלב המוקדם, מתחילים לצאת תאים שיתרמו ל־Cardiac mesoderm.

תאים אלה יוצאים מה־PS, נודדים לטרלית ולכיוון אנטריורי, ויוצרים את ה־cardiac fields. בהמשך יתפתח מהם הלב. התאים שיוצאים מוקדם יותר תורמים בעיקר לאזור חדרי הלב, ותאים שיוצאים מאוחר יותר תורמים לאזור העליות.

כדי להתחיל ספציפיקציה קרדיאלית צריך רמות גבוהות של BMP, Nodal ו־Wnt. אבל חשיפה ממושכת לרמות גבוהות שלהם מפריעה להתקדמות למסלול לבבי. לכן התאים צריכים קודם לקבל את האותות, ואז להתרחק מהם בזמן הנדידה הלטרלית והאנטריורית.

Eomes משנה תפקיד לפי הקשר הסיגנלים

Eomes הוא transcription factor שמתבטא באזור הפוסטריורי וב־PS.

בשלב מוקדם, כאשר יש רמות גבוהות של BMP, Nodal ו־Wnt, ה־Eomes מאפשר ביטוי של Mesp1 ו־Mesp2.

Mesp1/2 הם transcription factors שמקדמים ספציפיקציה של Cardiac mesoderm.

באותו זמן, Mesp1/2 גורמים גם לביטוי של Lefty2, שמעכב Nodal ותורם להיפוך דפוס הפעילות שלו. זה חשוב כדי שהאזור הקרדיאלי לא יישאר לאורך זמן תחת רמות גבוהות של Nodal.

כאשר ה־PS מתקדם והקומבינציה משתנה, Eomes כבר לא מוביל ל־Mesp1/2. ברמות Nodal גבוהות יחד עם Wnt/BMP נמוכים יותר, Eomes קשור לביטוי גנים כמו Foxa2, Sox17 ו־Gsc, שמאפיינים מסלול של DE / Mesendoderm.

לכן Eomes אינו “גן לב” פשוט. הוא פועל לפי ההקשר:

הנדידה של תאי Cardiac mesoderm לטרלית ואנטריורית מרחיקה אותם מהאזור שבו Nodal/BMP/Wnt גבוהים. כך הם יכולים להתקדם למסלול לבבי.

DKK1 ושמירה על אזור הראש

ה־AVE מבטא אנטגוניסטים כמו DKK1, שמעכב Wnt. כאשר DKK1 חסר, Wnt יכול להתפשט לאזור האנטריורי, והתוצאה היא עובר ללא ראש תקין. זה מדגים עד כמה חשוב לדחוק את מסלולי Wnt/BMP/Nodal/FGF לצד הפוסטריורי.

למה ה־PS נשאר צר?

ה־PS מתקדם מהצד הפוסטריורי לכיוון הדיסטלי, אבל הוא עושה זאת כרצועה צרה ומוגדרת. אם כל הסיגנלים הם גרדיאנטים, עולה השאלה: למה הרצועה לא מתפשטת לטרלית? למה היא לא “מזגזגת”?

התשובה שהוצגה היא חלקית, אבל הכיוון המרכזי ברור: השליטה אינה רק דרך גרדיאנטים של ליגנדים, אלא גם דרך Basal membrane ויכולת מקומית לבצע EMT.

פירוק Basal membrane הוא אירוע מוקדם

במודל הישן של EMT, הסדר היה בערך:

Adhesion disassembly
  ↓
Apical constriction
  ↓
Basal membrane degradation
  ↓
Ingression
  ↓
Migration

היום התמונה מדויקת יותר. באזור ה־PS רואים שה־Basal membrane degradation מתרחש מוקדם מאוד, עוד לפני סימנים מלאים של EMT.

בצביעה ל־Laminin, מרכיב של ה־Basal membrane, רואים שהממברנה הבזלית נשמרת משני צידי ה־PS, אבל מתפרקת ברצועה צרה באזור עצמו. באותו אזור רואים גם ביטוי צר של Snail.

לכן הרצועה שבה מתפרקת ה־Basal membrane מגדירה איפה תאים יכולים לצאת.

Apical constriction אינו מספיק בלי פירוק Basal membrane

תא אפיתליאלי יכול לעבור Apical constriction: הצד האפיקלי מתכווץ, והתא משנה צורה. אבל אם ה־Basal membrane נשאר שלם, התא לא יכול לעבור החוצה. הוא מתעגל או מתקפל, אך נשאר מוגבל על ידי הממברנה.

כדי שהתא יעבור Ingression צריך שילוב:

Basal membrane breakdown
  +
Apical constriction
  +
controlled changes in cell-cell junctions

בצילומי time-lapse של תאים באזור ה־PS רואים שתא יכול להתחיל Apical constriction בזמן ש־Adherens junctions עדיין קיימים. כלומר, אין כאן פירוק פשוט ומיידי של כל הקשרים בין התאים; זה תהליך הדרגתי ומבוקר.

RhoA, GEF ו־Actomyosin

Apical constriction דורש הפעלה של RhoA, שהוא small G protein.

הצורה הפעילה של RhoA היא עם GTP, והצורה הלא פעילה היא עם GDP. בתרשים למעלה יש טעות: GEF לא “מעיף GTP”, אלא מחליף GDP ב־GTP.

RhoA-GDP  --GEF-->  RhoA-GTP

RhoA פעיל מפעיל:

• Formin - מסייע ליצירת פילמנטים של Actin
• קינאזות שמפעילות Myosin II
• יחד מתקבל מבנה Actomyosin שיכול להתכווץ

כאשר RhoA מופעל בצד האפיקלי, מתקבל Apical constriction.

המודל: Basal RhoA, microtubules ו־integrins

בצד הבזלי של תאי Epiblast יש קשר בין התא לבין ה־Basal membrane דרך Integrins. הקשר הזה נתמך על ידי Microtubules, ותלוי בפעילות RhoA בזלית שמופעלת על ידי GEF בשם Net1.

המודל:

Basal Net1/RhoA active
  ↓
Microtubules stable
  ↓
Integrins maintain contact with Basal membrane
  ↓
Basal membrane remains intact

כאשר פעילות RhoA הבזלית יורדת:

Loss of basal Net1/RhoA
  ↓
Microtubules disrupted
  ↓
Integrin-Basal membrane contact weakens
  ↓
Basal membrane degradation
  ↓
Apical constriction can lead to ingression

המודל מסביר איך פירוק מקומי של Basal membrane מאפשר יציאה של תאים רק באזור צר של ה־PS.

חלבוני Basal membrane שמגבילים את ה־PS

TSR ו־POFUT2

קבוצת חלבונים גדולה שקשורה ל־Extracellular matrix ול־Basal membrane מכילה דומיין בשם Thrombospondin type 1 repeat (TSR).

בדומיין הזה יש אתר שיכול לעבור O-fucosylation (הוספת סוכר מסוג fucose על threonine).

האנזים POFUT2 מבצע את הפוקוזילציה הזאת. הפוקוזילציה חשובה לתפקוד תקין של חלבונים שנמצאים בסביבת ה־Basal membrane.

במוטנט ל־POFUT2 מתקבל PS רחב יותר, ויותר Mesoderm. כלומר, כאשר תפקוד חלבוני ה־Basal membrane נפגע, פירוק הממברנה לא נשאר מוגבל לרצועה צרה, ותהליך ה־EMT מתפשט.

המסקנה: Basal membrane תקין עוזר להגביל את ה־PS לרצועה צרה.

FLRT3 מגן על הצד האנטריורי

חלבוני FLRT1-3 הם חלבונים טראנסממברנליים שיכולים ליצור אינטראקציות הומוטיפיות בין תאים. FLRT3 מתבטא באזור האנטריורי, בעיקר באזור ה־AVE.

כאשר עושים מוטציה ב־FLRT3, מתחיל EMT גם בצד האנטריורי. כלומר, הצד האנטריורי מאבד חלק מהיכולת לשמור על Basal membrane תקין ולמנוע יציאה של תאים.

במוטנט כזה אין PS מסודר ומוגבל כנדרש. לכן FLRT3 משתתף בשמירה על הגבול האנטריורי, ומונע התפשטות לא נכונה של EMT.

Notochord, שלוש שכבות והקשר לאורגנוגנזה

לקראת סוף הגסטרולציה נוצר ה־Axial mesoderm, שממנו נוצרים בין היתר:

• Prechordal plate
• Anterior head process
• Node
• Notochord / Notochordal plate

התאים שיוצרים את ה־Notochord הם תאים שמקורם ב־Mesoderm. הם יצאו דרך ה־PS, נדדו לאורך הציר המרכזי, עברו MET, קיבלו מאפיינים אפיתליאליים, ובהמשך עברו תנועה פנימה באמצעות Apical constriction.

חשוב לדייק:

• מבחינת מקור התפתחותי, אלה תאי Mesoderm.
• מבחינת צורה ותכונות בשלב הזה, הם תאים אפיתליאליים.
• הם אינם תאי Mesenchyme בשלב שבו הם עוברים Apical constriction.
• Apical constriction דורש תא עם צד אפיקלי וצד בזלי, ולכן מתאים לתאים אפיתליאליים.

בסוף הגסטרולציה מתקבלות שלוש שכבות נבט:

המשך ההתפתחות, כלומר Organogenesis, מתבסס על אינטראקציות בין שלוש השכבות הללו.

עכבר לעומת אדם

העקרונות שנלמדו בעכבר רלוונטיים גם לאדם, אבל הטופוגרפיה שונה.

בעכבר העובר הוא Egg cylinder. באדם ובפרימטים המבנה דומה יותר ל־disc. לכן כיווני התנועה נראים אחרת במרחב, אף שהעיקרון ההתפתחותי שמור.

הבדלים מרכזיים:

בפרימטים רואים אזור קדמי שמבטא אנטגוניסטים כמו Cerberus1 ו־DKK1, ואזור פוסטריורי שבו נשמרים סיגנלים כמו BMP/Wnt/Nodal. כמו בעכבר, השילוב בין דיכוי אנטריורי לבין פעילות פוסטריורית מאפשר להגדיר את צירי הגוף ולהתחיל גסטרולציה בצורה מסודרת.

רצף האירועים המרכזי

Posterior epiblast
  ↓
FGF8/FGFR1 signaling
  ↓
Snail expression
  ↓
E-cadherin repression
  ↓
EMT and ingression through the PS

DVE → AVE
  ↓
Cerberus1 / Lefty1 / DKK1
  ↓
Posterior restriction of Nodal / BMP / Wnt / FGF
  ↓
Anterior-posterior gradients
  ↓
Different mesodermal fates by position and time

Early PS
  ├─ Extra-embryonic mesoderm
  └─ PGCs
       └─ BMP → Blimp1 → repression of somatic/ExM program

Intermediate PS
  ├─ Lateral plate mesoderm
  ├─ Paraxial mesoderm
  └─ Cardiac mesoderm
       └─ Eomes → Mesp1/2

Late / Anterior PS
  ├─ Axial mesoderm
  ├─ Mesendoderm
  └─ DE

Basal membrane control
  ↓
localized BM breakdown
  ↓
narrow PS
  ↓
controlled ingression