שיעור 10 המשך גסטרולציה: EMT וקביעת גורלות

פתיחה: מטרת השיעור

בשיעור הקודם הגסטרולציה תוארה בעיקר מבחינה אנטומית: ה־Primitive Streak (להלן: PS), יציאת תאים מה־Epiblast, יצירת Mesoderm, כניסת תאים ל־Definitive Endoderm (להלן: DE), ובהמשך יצירת Axial mesoderm ונוטוכורד (Notochord).

בשיעור הנוכחי נעבור לשאלות ברמת המנגנון:

1. איך מתבצע EMT ב־PS?
2. איך תאים שונים שיוצאים דרך ה־PS מקבלים גורלות שונים?
3. למה ה־PS מתקדם ברצועה צרה ולא מתפשט לכל הכיוונים?
4. איך הוא נעצר בנקודה הדיסטלית?
5. איך כל זה קשור ל־Snail, ‏FGF, ‏Nodal, ‏BMP, ‏Wnt, ‏Eomes ו־Basal membrane?

Snail, ‏FGF ו־EMT ב־PS

Snail כגורם מרכזי ב־EMT

Snail הוא פקטור שעתוק ממשפחת חלבוני zinc finger. הוא בעיקר פועל כרפרסור של שעתוק.

ב־in situ hybridization (ביטוי RNA) רואים ש־Snail מתבטא באזור ה־early PS - דפוס ביטוי שמעלה שאלה ישירה: מה תפקידו של Snail? האם Snail משתתף ביצירת ה־PS, ביצירת Mesoderm או בתהליך ה־EMT עצמו?

בניסוי loss of function ל־Snail משווים בין עובר תקין ומוטנט: בעובר התקין, רואים אפיבלסט/אקטודרם, שכבת Mesoderm, שכבה שמתקרבת ל־DE, וגם קרומים כמו Amnion ו־Chorion; במוטנט ל־Snail, העובר קטן יותר, ה־Amnion לא נוצר באופן תקין, ורוב ה־Mesoderm חסר.

בכל זאת, באזור שבו אמור להיווצר ה־PS מופיעה קבוצה קטנה של תאים בין ה־Epiblast לבין ה־Visceral endoderm (להלן: VE). כלומר, יש התחלה מסוימת של Ingression ושל יצירת Mesoderm, אבל התהליך חלש ולא ממשיך כרגיל.

הפנוטיפ המרכזי:

בחתכים ובמיקרוסקופ אלקטרונים, התאים שיוצאים במוטנט אינם נראים כמו תאים מזנכימליים רגילים. הם מסודרים בשורות, יוצרים חללים קטנים, ומציגים מאפיינים של תאי אפיתל כמו Tight junctions ו־Microvilli.

לכן Snail דרוש ל־EMT תקין. בלעדיו, חלק מהתאים אמנם יכולים להתחיל לצאת, אבל הם לא מאמצים ולא שומרים על תכונות מזנכימליות.

Snail מדכא E-cadherin

בשלב הבא בודקים את E-cadherin, חלבון מרכזי ב־Adherens junctions של תאי אפיתל.

• ב־Wild type, תאי Mesoderm שעברו EMT כמעט לא מבטאים E-cadherin.
• במוטנט ל־Snail, התאים שיצאו מה־Epiblast עדיין מבטאים E-cadherin ברמת ה־RNA וברמת החלבון.

המודל:

Snail ⊣ E-cadherin ⊣ EMT

Snail נקשר לפרומוטור של E-cadherin ומדכא את השעתוק שלו. לכן הרגולציה כאן היא בעיקר ברמת השעתוק.

FGFR1 וניתוח כימרות

גם מוטציה ב־FGFR1 פוגעת בגסטרולציה, ויוצרת פנוטיפ שמזכיר חלקית את הפנוטיפ של Snail. במוטנט, רואים הצטברות של תאים באזור ה־PS, וחלק מהתאים אמנם יוצאים, אבל רבים מהם אינם יוצרים Mesoderm תקין. גם התאים שנמצאים בצד המזודרמלי אינם נראים לגמרי כמו תאים מזנכימליים רגילים, אלא שומרים על מאפיינים אפיתליאליים.

הבעיה בניסוי Knockout רגיל היא שהעובר המוטנטי לא יכול להמשיך להתפתח כרגיל. לכן קשה לדעת האם FGFR1 דרוש באופן ישיר לכל תא שעובר דרך ה־PS, או שהפנוטיפ נובע מקריסה כללית של העובר.

כדי לבדוק זאת משתמשים ב־Chimeric analysis.

בניסוי כזה צריך דרך לעקוב אחרי קבוצת תאים מסוימת, בתוך עובר שמכיל גם תאים אחרים. לשם כך, משתמשים בלוקוס Rosa26 (lncRNA). זהו לוקוס שמתבטא בהרבה תאים ואינו חיוני להתפתחות בתנאי המעבדה, ולכן אפשר להכניס אליו את הגן LacZ ולהשתמש בו כסמן.

LacZ מקודד לאנזים חיידקי בשם β-galactosidase. כאשר מוסיפים את הסובסטרט X-gal, האנזים מפרק אותו ונוצר תוצר כחול ובלתי מסיס. לכן כל תא שמבטא LacZ נצבע בכחול, ואפשר לעקוב אחריו בעובר.

בשלב הבא מייצרים embryonic stem cells (ESC) שמסומנים ב־LacZ:

• תאי ביקורת: מסומנים בכחול באמצעות ROSA26 LacZ/LacZ, אבל מבחינת FGFR1 הם אינם knockout מלא. הם Fgfr1/+, ולכן מתנהגים כביקורת פונקציונלית (+ מסמן כאן אלל תקין. ו־Fgfr1 מוטנט).
• תאי ניסוי: מסומנים בכחול באמצעות ROSA26 LacZ/LacZ, וגם חסרי FGFR1 באופן מלא: Fgfr1/Fgfr1.

את התאים האלה מזריקים לבלסטוציסט תקין. כך מתקבל עובר כימרי: חלק מהתאים מגיעים מהבלסטוציסט התקין ואינם כחולים, וחלק מהתאים מגיעים מה־ESC שהוזרקו ולכן הם כחולים.

חשוב לדייק: הצבע הכחול כשלעצמו אינו הבעיה ואינו המשתנה הנבדק. גם בביקורת יש תאים כחולים. ההבדל בין ביקורת לניסוי הוא האם התאים הכחולים הם תקינים או מוטנטים ל־FGFR1.

בכימרות ביקורת, התאים הכחולים מתפזרים באופן רגיל. הם יכולים להגיע ל־PS, לצאת דרכו, להשתלב ב־Mesoderm ולנדוד לטרלית יחד עם שאר התאים.

בכימרות שבהן התאים הכחולים הם מוטנטים ל־FGFR1, רואים תמונה אחרת. התאים המוטנטים כן מגיעים לאזור ה־PS, ולכן FGFR1 אינו דרוש לעצם ההגעה שלהם לשם. אבל לאחר שהם מגיעים, רבים מהם נתקעים באזור ה־PS או נשארים ב־Epiblast. במקביל, התאים התקינים באותו עובר כן יוצאים, יוצרים Mesoderm ונודדים לטרלית.

בשלבים מאוחרים יותר רואים שה־Epiblast נעשה עשיר יותר בתאים כחולים, מפני שהתאים התקינים כבר יצאו החוצה, ואילו התאים המוטנטים נשארו מאחור. חלק מהתאים המוטנטים יכולים בסוף לצאת, אבל הם כמעט לא משתלבים כראוי ב־Mesoderm הנודד.

המסקנה היא שהפגם הוא cell autonomous: התאים המוטנטים עצמם חסרי יכולת להגיב נכון ל־FGF signaling. הסביבה העוברית הכללית עדיין מאפשרת גסטרולציה, כי התאים התקינים באותו עובר מתנהגים כרגיל. לכן, ‏FGFR1 דרוש לתא עצמו כדי לעבור בצורה תקינה דרך ה־PS, להשלים EMT ולהשתלב ב־Mesoderm.

המסקנה: FGFR1 דרוש לתאים כדי לצאת בצורה תקינה דרך ה־PS, ולהשתלב ב־Mesoderm הנודד.

תשומת הלב שתאי האפיבלסט ב־FGFR1-null הצליחו להגיע לאזור ה־PS, אזי ש־FGFR1 כנראה אינו דרוש לנדידה הראשונית לאזור ה־PS, אלא לשלבים downstream כמו EMT, ‏ingreasion, או נדידה לטרלית.

FGF8 הוא הליגנד הרלוונטי באזור ה־PS

FGF8 מתבטא באזור הפוסטריורי של ה־Epiblast, במקום שבו יתחיל ה־PS. במוטנט ל־FGF8 מתקבל פנוטיפ דומה: התפתחות קטנה יותר, הצטברות תאים באזור ה־PS, ותאים בעלי מאפיינים אפיתליאליים שאינם נודדים כרגיל.

הקשר בין FGF ל־Snail נבדק ישירות באמצעות in situ hybridization ל־Snail במוטנטים ל־FGFR1.

• ב־Wild type - רואים ביטוי ברור של Snail באזור ה־PS.
• במוטנט ל־FGFR1 - הביטוי של Snail יורד מאוד או נעלם.

לכן המסלול המרכזי הוא:

Fgf8 -• Fgfr1 → Snail ⊣ E-cadherin ⊣ EMT

המסלול הזה חשוב, אבל הוא לא כל הסיפור. EMT כולל עוד מנגנונים: פירוק Basal membrane, שינוי ארגון הציטוסקלטון, שינוי בקשרים בין תאים, ורגולציה נוספת של E-cadherin ברמות שאינן רק שעתוק.

Mesoderm Specification: איך תא מקבל גורל

תאי Mesoderm יכולים לתת מגוון אוכלוסיות:

• Extra-embryonic mesoderm (להלן: ExM)
• PGCs
• Lateral plate mesoderm
• Paraxial mesoderm
• Cardiac mesoderm
• Axial mesoderm
• Mesendoderm
• DE

גורל התא נקבע לפי שילוב של שני פרמטרים:

אותה נקודה גאוגרפית ב־PS אינה נותנת תמיד אותו גורל. תא שיוצא מוקדם ותא שיוצא מאוחר מאותו אזור יכולים לראות קומבינציות שונות של סיגנלים.

מגרדיאנט Proximal-Distal לגרדיאנט Anterior-Posterior

לפני הגסטרולציה קיימים גרדיאנטים על הציר proximal-distal ↕, בעיקר של Nodal, BMP ו־Wnt.

כאשר ה־DVE נודד והופך ל־AVE, הוא מבטא אנטגוניסטים כמו Cerberus1, ‏Lefty1 ו־DKK1, שדוחקים את הפעילות של Nodal, ‏Wnt ו־BMP לכיוון הפוסטריורי (→).

כך הציר שהיה קודם לכן proximal-distal מקבל משמעות של anterior-posterior. זו המשמעות המולקולרית של ה־P-D axis rotation: דפוסי הסיגנלינג מתארגנים מחדש כך שהצד הקדמי מדכא אותם, והצד האחורי שומר עליהם.

גם FGF8 נכנס לתמונה בצד הפוסטריורי, ולכן בשלב הזה יש ארבעה גרדיאנטים חשובים לאורך הציר anterior-posterior:

• Nodal
• BMP
• Wnt
• FGF

בכל נקודה לאורך ה־PS מתקבלת קומבינציה אחרת של רמות סיגנלינג.

התהפכות גרדיאנט Nodal

במהלך התקדמות ה־PS, דפוס הביטוי של Nodal משתנה. בתחילת הדרך, הביטוי חזק בצד הפוסטריורי, ובהמשך הגרדיאנט מתהפך.

הנקודה החשובה היא לא רק המיקום, אלא גם הזמן: תא שיוצא מאותה נקודה בשני זמנים שונים יכול לראות רמות אחרות של Nodal. לכן גורל התא תלוי גם בטופוגרפיה וגם בזמן.

Early PS - ה־PGCs מול ה־Extra-embryonic Mesoderm

בשלב Early PS יוצאים בעיקר שני סוגי תאים:

1. ExM
2. Primordial germ cells (PGCs)

שניהם יוצאים מאזור דומה: ה־posterior proximal epiblast. רוב התאים יהפכו ל־ExM, ורק קבוצה קטנה, בערך עשרות תאים, תעבור ספציפיקציה ל־PGCs.

Blimp1/Prdm1 מסמן את קו תאי המין הראשוניים

Blimp1, שנקרא גם Prdm1, הוא פקטור שעתוק ממשפחת zinc finger שפועל כרפרסור (מזכיר Snail). הוא חשוב לספציפיקציה הראשונית של PGCs.

במודל שבו GFP מוכנס ללוקוס של Blimp1, כל תא שמבטא Blimp1 מסומן בירוק. רואים Blimp1 ב־VE, אבל בהקשר של PGCs מתמקדים בקבוצה קטנה של תאים ב־Epiblast - באזור הפוסטריורי-פרוקסימלי (נמצאים שם עוד לפני יציאת ה־PS).

בשלבים מתקדמים יותר, תאי PGC נמצאים באזור שמתחת ל־allantoic bud. בהמשך ההתפתחות, הם ינדדו דרך אזור ה־hindgut אל הגונדות המתפתחות.

ניסוי קילוף שכבות: VE מעכב PGCs, וה־ExE מספק סיגנל חיובי

כדי להבין למה רק מעט תאים הופכים ל־PGCs (כ־60-50 תאים PGCs בעוד השאר ExM), מבצעים ניסויי תרבית בעוברים מוקדמים.

התוצאות העיקריות:

המסקנה:

• VE מפריש גורם שמעכב יצירת PGCs ב־Epiblast (שכן כאשר מסירים אותו, PGCs מופיעים בכל מקום).
• ExE מספק סיגנל שמתגבר על העיכוב הזה באזור הפוסטריורי-פרוקסימלי.

כך מתקבלת regionalization: רק תאים שנמצאים באזור הנכון (Posterior Proximal Epiblast) יכולים להפוך ל־PGCs.

בשאלה שהופיע בבוחן עלתה השאלה האם ExE חיוני ליצירת PGCs. התשובה היא כן, למרות שראינו ש־PGCs יכולים להיווצר גם בלעדיו. לצורך הקורס, ״חיוני״ ככל הנראה מתייחס גם לגורמים שאינם הכחריים.

BMP4, ‏Nodal ו־Blimp1

BMP4 (שנמצא בעיקר באזור הפוסטריורי) הוא הסיגנל שמאפשר ביטוי של Blimp1 בתאים הקרובים ל־ExE. במקביל, Nodal (שתחילה באזור הפוסטריורי אך לאחר היפוך באנטריורי) גורם ל־VE לייצר גורם מעכב שמונע מתאי Epiblast רבים להפוך ל־PGCs.

Blimp1 מדכא בתא את התוכנית הסומטית, בעיקר תוכנית של ExM. כך, תא שמבטא Blimp1 לא ממשיך למסלול המזודרמלי הרגיל (ל־ExM), אלא נשמר במסלול של PGC.

ExE → BMP4 → Blimp1 ⊣ ExM (Somatic Program)
       ↓       ↓
      ExM     PGCs

הנקודה שנשארת פתוחה: באותו אזור יש הרבה תאים שנחשפים ל־BMP, אבל רק חלק קטן מהם מבטאים Blimp1 והופכים ל־PGCs. בשיעור לא ניתנה תשובה מלאה לשאלה הזאת.

Cardiac Mesoderm ו־Eomes

כאשר ה־PS מתקדם מעבר לשלב המוקדם, מתחילים לצאת תאים שיתרמו ל־Cardiac mesoderm.

תאים אלה יוצאים מה־PS, נודדים לטרלית ולכיוון אנטריורי, ויוצרים את ה־cardiac fields. בהמשך יתפתח מהם הלב.

• התאים שיוצאים מוקדם יותר, תורמים בעיקר לאזור חדרי הלב (ventricle).
• תאים שיוצאים מאוחר יותר, תורמים לאזור העליות (atria).

כדי להתחיל ספציפיקציה קרדיאלית צריך רמות גבוהות של BMP, ‏Nodal ו־Wnt (כולם נמצאים ב־Early PS).

מצד שני, חשיפה ממושכת לרמות גבוהות שלהם (בעיקר Nodal) מפריעה להתקדמות למסלול לבבי. לכן התאים צריכים קודם לקבל את האותות, ואז להתרחק מהם בזמן הנדידה הלטרלית והאנטריורית.

Eomes משנה תפקיד לפי הקשר הסיגנלים

Eomes הוא פקטור שעתוק שמתבטא באזור הפוסטריורי וב־PS (בדומה ל־Snail). בהמשך הוא עובר אנטריורית (בדומה ל־Nodal) ולבסוף נעלם.

בשלב מוקדם, כאשר יש רמות גבוהות של BMP, ‏Nodal ו־Wnt, ה־Eomes מאפשר ביטוי של Mesp1/2.

Mesp1/2 הם פקטורי שעתוק שמקדמים ספציפיקציה של Cardiac mesoderm.

בד בבד, Mesp1/2 גורמים גם לביטוי של Lefty2, שמעכב את Nodal ותורם להיפוך דפוס הפעילות שלו. זה חשוב כדי שהאזור הקרדיאלי לא יישאר לאורך זמן תחת רמות גבוהות של Nodal.

Nodal הוא חיוני כדי להפעיל את Eomes, אבל אם הוא נשאר גבוה מדי זמן רב, הוא מפריע להתקדמות למסלול לבבי. לכן Lefty2 פועל כמשוב שלילי: הוא מדכא את Nodal, וכך מאפשר לתאים להמשיך במסלול Cardiac mesoderm.

כאשר ה־PS מתקדם והקומבינציה משתנה, ‏Eomes כבר לא מוביל ל־Mesp1/2: ברמות Nodal גבוהות יחד עם Wnt/BMP נמוכים יותר, Eomes קשור לביטוי גנים כמו Foxa2/Sox17/Gsc, שמאפיינים מסלול DE/Mesendoderm.

לסיכום, Eomes פועל לפי ההקשר:

נדידת תאי Cardiac mesoderm לטרלית ואנטריורית מרחיקה אותם מהאזור שבו Nodal/BMP/Wnt גבוהים, וכך הם יכולים להתקדם למסלול לבבי.

התפתחות הראש

DKK1 ושמירה על אזור הראש

ה־AVE מבטא אנטגוניסטים כמו DKK1, שמעכבים Wnt. כאשר DKK1 חסר, Wnt יכול להתפשט לאזור האנטריורי, והתוצאה היא עובר ללא ראש תקין. זה מדגים עד כמה חשוב לדחוק את מסלולי Wnt/BMP/Nodal/FGF לצד הפוסטריורי.

DKK מעכב Wnt שמעכב התפתחות של הראש; הוא מאפשר התפתחות תקינה של הראש על ידי שמירה על אזור נקי מ־Wnt. יש כאן מעין שלילה כפולה - הוא לא יוצר את הראש, אלא חוסם סיגנל Wnt שמדכא את ההתפתחות שלו.

למה ה־PS נשאר צר?

ה־PS מתקדם מהצד הפוסטריורי דיסטלית, תוך שהוא נשאר על רצועה צרה ומדויקת. השאלה היא למה הוא לא מתפשט לטרלית, אם הסיגנלים שמפעילים גסטרולציה קיימים כגרדיאנטים.

ההסבר המלא יוצג בהמשך. בקצרה, הוא נע בקו מדויק באפיבלסט ועוצר בנקודה הדיסטלית בגלל שני גורמים:

1. ירידה ברמות הסיגנלינג של FGF/Wnt/Nodal/BMP
2. ירידה ביכולת המקומית של תאים לעבור EMT

הנקודה המרכזית היא שהגבול של ה־PS לא נקבע רק לפי סיגנלים כמו FGF/Wnt/Nodal/BMP, אלא גם לפי היכולת המקומית של תאים לעבור EMT בפועל. כדי שתא יצא מה־Epiblast, לא מספיק להפעיל תוכנית מולקולרית של EMT; צריך גם לפרק באזור הזה את ה־Basal membrane.

פירוק Basal membrane הוא אירוע מוקדם

במודל הישן של EMT, חשבו שהתהליך מתקדם בסדר הבא: קודם פירוק קשרים בין תאים, אחר כך Apical constriction, אחר כך פירוק ה־Basal membrane, ורק אז Ingression ו־Migration, כלומר:

1. EMT
   I.  Adhesion disassembly
   II. Apical constriction
2. Basal membrane degradation
3. Ingression: extnsion
4. Ingression: rounding up
5. Migration

המודל הזה פשוט מדי. לפי מה שהוצג בשיעור, באזור ה־PS פירוק ה־Basal membrane מתרחש מוקדם מאוד (ראשון), ברצועה צרה.

בצביעה ל־Laminin, שהוא מרכיב של הממברנה הבזלית, רואים שהממברנה נשמרת בצדדים אבל נעלמת ברצועה צרה באזור ה־PS. באותו אזור מופיע גם ביטוי של Snail. לכן המקום שבו הממברנה מתפרקת, הוא המקום שבו תאים יכולים להתחיל לצאת מה־Epiblast.

Apical constriction לא מספיק ל־Ingression

באיור:

• התאים הבהירים מימין - VE
• התאים בתכלת - Mesoderm
• התאים הרחבים יותר שמסודרים אחד על השני - Epiblast, הצד הבזלי פונה למזודרם והאפיקלי הנגדי.
• התא החום מציג Apical constriction.

Apical constriction הוא כיווץ של הצד האפיקלי של תא אפיתליאלי. הכיווץ משנה את צורת התא, אבל הוא לא מספיק כדי שהתא יעבור Ingression. אם ה־Basal membrane עדיין קיימת, היא חוסמת פיזית את יציאת התא.

לכן, כאשר יש Apical constriction בלי פירוק Basal membrane, התא יכול להתארך, להתקפל או להתעגל, אבל הוא לא באמת יוצא מהאפיתל; כדי שתהיה Ingression צריך גם כיווץ אפיקלי וגם פירוק של המחסום הבזלי.

Basal membrane breakdown
  +
Apical constriction
  +
controlled changes in cell-cell junctions

בצילומי time-lapse רואים שהתהליך הדרגתי: התא יכול להתחיל Apical constriction בזמן ש־Adherens junctions עדיין קיימים. כלומר, EMT ב־PS הוא מעבר מבוקר שבו חלק מהמאפיינים האפיתליאליים משתנים בשלבים.

RhoA מפעיל את מנגנון הכיווץ

RhoA הוא small G protein. הוא פעיל כשהוא קשור ל־GTP (קרי, RhoGTP), ולא פעיל כשהוא קשור ל־GDP (היינו, RhoGDP).

GEF מפעיל את RhoA על ידי החלפת GDP ב־GTP; בתרשים למעלה נפלה טעות, כי GEF לא ״מעיף GTP״, אלא מוציא GDP ומכניס GTP.

כאשר RhoA פעיל (RhoGTP), הוא מפעיל שני חלבונים חשובים:

• Formin - מסייע ליצירת פילמנטים של Actin (מווסת אותם).
• קינאזות שמפעילות Myosin II - בתמונה הן נקראות ROCK, אף שהשם לא נאמר בשיעור (למיטב זכרוני).

השילוב של Actin ו־Myosin II יוצר מבנה Actomyosin שיכול להתכווץ. כאשר ההפעלה הזאת מתרחשת בצד האפיקלי של התא, מתקבל Apical constriction.

אותו RhoA, אבל תלוי איפה הוא פועל

החשיבות של RhoA תלויה במיקומו בתא:

• בצד האפיקלי: RhoA פעיל מקדם Apical constriction דרך Actomyosin.

• בצד הבזלי: RhoA קשור דווקא לשמירה על הקשר בין התא ובין הממברנה. הקשר הזה מתווך דרך Integrins, נתמך על ידי Microtubules, ותלוי ב־GEF בשם Net1.

  • כאשר פעילות Net1/RhoA הבזלית נשמרת, ה־Microtubules יציבים, ה־Integrins ממשיכים להחזיק את התא על ה־Basal membrane, והממברנה נשארת שלמה.

  • כאשר פעילות Net1/RhoA הבזלית יורדת, ה־Microtubules נפגעים, הקשר דרך Integrins נחלש, וה־Basal membrane יכולה להתפרק. אז Apical constriction כבר יכול להוביל ל־Ingression אמיתי.

לכן ה־PS נשאר צר: רק באזור מוגבל יש פירוק מוקדם של ה־Basal membrane, יחד עם מנגנון כיווץ אפיקלי. בצדדים (לטרלית), שבהם ה־Basal membrane נשמרת, התאים לא יכולים לצאת גם אם קיימים סיגנלים התפתחותיים בסביבה.

הערה: לא בטוח שהבנתי מה הסיגנל המדויק שמוריד את Net1/RhoA הבזלי. בכל מקרה, הירידה הזאת היא מנגנון שמאפשר פירוק BM מקומי, ולכן שומר את ה־PS צר. היא מתרחשת מוקדם מאוד באזור ה־PS, לפני איבוד מלא של Tight junctions ולפני שינוי משמעותי ב־Adherens junctions. זה קורה בעיקר בתאי Epiblast המדיאליים של ה־PS, לא בצדדים הלטרליים.

המודל: Basal RhoA, ‏microtubules ו־integrins

המודל:

          Lateral epiblast        Medial PS
          ────────────────        ─────────
APICAL    RhoA inactive           RhoA active
          weak actomyosin         actomyosin contracts
                │                       ↓
                │                 apical constriction
                │                       ↓
                │                 ingression

BASAL     Net1/RhoA active        Net1/RhoA inactive
          microtubules stable     microtubules disrupted
        integrins hold BM       integrins detach from BM
                │                       ↓
          BM stays intact         BM breaks locally

          ████████████████        ████      ████
          no exit                 local exit point

כשפעילות RhoA בזלי נשמרת:

Basal Net1/RhoA active
  ↓
Microtubules stable
  ↓
Integrins maintain contact with Basal membrane
  ↓
Basal membrane remains intact

כאשר פעילות RhoA הבזלית יורדת:

Loss of basal Net1/RhoA
  ↓
Microtubules disrupted
  ↓
Integrin-Basal membrane contact weakens
  ↓
Basal membrane degradation
  ↓
Apical constriction can lead to ingression

המודל מסביר איך פירוק מקומי של Basal membrane, מאפשר יציאה של תאים רק באזור צר של ה־PS.

חלבונים ממברנליים שמגבילים את ה־PS

TSR ו־POFUT2

Thrombospondin type 1 repeat (TSR) superfamily, היא קבוצת חלבונים גדולה שקשורה למטריקס החוץ־תאי ולממברנה הבזלית, וכל חבריה מכילים דומיין בשם TSR.

בדומיין TSR יש אתר שיכול לעבור O-fucosylation: הוספת סוכר מסוג פוקוז על חומצת האמינו תראונין.

האנזים POFUT2 מבצע את הפוקוזילציה הזאת (נפגשנו בו בעבר, בשיעור על Notch). הפוקוזילציה דרושה לתפקוד תקין של חלבוני TSR בסביבת ה־Basal membrane.

כאשר POFUT2 נפגע, מתקבל PS רחב יותר ונוצר יותר Mesoderm. מכאן שה־Basal membrane אינה רק שכבת תמיכה פסיבית. היא חלק ממנגנון שמגביל את האזור שבו תאים יכולים לעבור EMT.

במצב תקין, חלבוני TSR שעברו פוקוזילציה עוזרים לשמור על Basal membrane מחוץ לרצועת ה־PS. כך תאים לטרליים נשארים מוגבלים באפיתל ולא עוברים Ingression. כאשר המנגנון הזה נפגע, המחסום הבזלי פחות יציב, ולכן EMT יכול להתפשט לצדדים.

FLRT3 מגן על הצד האנטריורי

משפחה נוספת שנכנסת כאן היא FLRT1-3. אלה חלבונים טרנסממברנליים שיכולים להשתתף באינטראקציות בין תאים. בהקשר הזה, נתמקד ב־FLRT3, שמתבטא באזור האנטריורי, בעיקר באזור ה־AVE.

הביטוי האנטריורי של FLRT3 מתאים לתפקידו: לשמור על האזור האנטריורי כאזור שבו לא מתרחש EMT. ה־FLRT3 עוזר לתחזק שם את ה־Basal membrane (לא יודעים בדיוק איך), ולכן מונע יציאת תאים מה־Epiblast במקום הלא נכון.

כאשר עושים מוטציה ב־FLRT3, מתחיל EMT גם בצד האנטריורי.

חשוב לדייק: במוטנט ל־FLRT3 לא נוצר PS אנטריורי מסודר. מה שרואים הוא EMT לא תקין באזור האנטריורי: ה־Basal membrane אינה מתוחזקת היטב, היא עוברת דגרדציה, ותאים מתחילים לצאת. לכן FLRT3 לא מגדיר את ה־PS עצמו, אלא מונע EMT באזור שבו הוא לא אמור להתרחש.

הגבלת ה־PS בצדדים ובאנטריור

במרכז ה־PS פועלים מסלולים שמקדמים EMT: ה־FGF מפעיל את Snail, ו־Snail מוריד E-cadherin. בנוסף, Nodal מפעיל את Eomes, שגם משתתף בהורדת E-cadherin. יחד עם פירוק הממברנה הבזלית, התאים יכולים לצאת מה־Epiblast.

מחוץ ל־PS (ב־Lateral ectoderm) פועלים מנגנונים שמגבילים את התהליך.

בצדדים, פוקוזילציה של חלבוני TSR דרך POFUT2 עוזרת למנוע התפשטות לטרלית של ה־PS. בנוסף, יש יחסי עיכוב (feedback loop) בין Snail לבין Sox3:

• באזור ה־PS, ה־Snail מונע ביטוי של Sox3
• באזורים לטרליים, Sox3 מדכא את Snail

כך נוצר גבול ברור יותר בין אזור שעובר EMT לבין אזורים שנשארים אפיתליאליים.

באזור האנטריורי, FLRT3 מתחזק את ה־Basal membrane ומונע EMT קדמי.

לכן, הגבלת ה־PS תלויה במנגנונים משני סוגים: הפעלה של EMT במקום הנכון, ושמירה על Basal membrane באזורים שבהם EMT צריך להיחסם.

נוטוכורד, שלוש שכבות והקשר לאורגנוגנזה

לקראת סוף הגסטרולציה נוצר ה־Axial mesoderm, שממנו נוצרים בין היתר:

• Prechordal plate
• Anterior head process
• Node
• Notochord/Notochordal plate

התאים שיוצרים את הנוטוכורד הם תאים שמקורם ב־Mesoderm. הם יצאו דרך ה־PS, נדדו לאורך הציר המרכזי, עברו MET, קיבלו מאפיינים אפיתליאליים, ובהמשך עברו תנועה פנימה באמצעות Apical constriction.

חשוב לדייק:

• מבחינת מקור התפתחותי, אלה תאי Mesoderm.
• מבחינת צורה ותכונות בשלב הזה, הם תאים אפיתליאליים.
• הם אינם תאי Mesenchyme בשלב שבו הם עוברים Apical constriction, שכן Apical constriction דורש תא עם צד אפיקלי וצד בזלי, ולכן מתאים לתאים אפיתליאליים.

סוף הגסטרולציה: שלוש שכבות נבט

בסוף הגסטרולציה מתקבלות שלוש שכבות נבט:

המשך ההתפתחות, כלומר Organogenesis, מתבסס על אינטראקציות בין שלוש השכבות הללו.

עכבר לעומת אדם

העקרונות שנלמדו בעכבר רלוונטיים גם לאדם, אבל הטופוגרפיה שונה.

בעכבר העובר הוא Egg cylinder. באדם ובפרימטים המבנה דומה יותר ל־disc. לכן כיווני התנועה נראים אחרת במרחב, אף שהעיקרון ההתפתחותי שמור.

הבדלים מרכזיים:

בפרימטים רואים אזור קדמי שמבטא אנטגוניסטים כמו Cerberus1 ו־DKK1, ואזור פוסטריורי שבו נשמרים סיגנלים כמו BMP/Wnt/Nodal. כמו בעכבר, השילוב בין דיכוי אנטריורי לבין פעילות פוסטריורית מאפשר להגדיר את צירי הגוף ולהתחיל גסטרולציה בצורה מסודרת.

רצף האירועים המרכזי

Posterior epiblast
  ↓
FGF8/FGFR1 signaling
  ↓
Snail expression
  ↓
E-cadherin repression
  ↓
EMT and ingression through the PS

DVE → AVE
  ↓
Cerberus1 / Lefty1 / DKK1
  ↓
Posterior restriction of Nodal / BMP / Wnt / FGF
  ↓
Anterior-posterior gradients
  ↓
Different mesodermal fates by position and time

Early PS
  ├─ Extra-embryonic mesoderm
  └─ PGCs
       └─ BMP → Blimp1 → repression of somatic/ExM program

Intermediate PS
  ├─ Lateral plate mesoderm
  ├─ Paraxial mesoderm
  └─ Cardiac mesoderm
       └─ Eomes → Mesp1/2

Late / Anterior PS
  ├─ Axial mesoderm
  ├─ Mesendoderm
  └─ DE

Basal membrane control
  ↓
localized BM breakdown
  ↓
narrow PS
  ↓
controlled ingression

elogation - כמו משחת שיניים.