שיעור 18 RNA Pol I ו-RNA Pol III

RNA Pol II - חזרה

לפני המעבר ל־Pol I ול־Pol III, נפתח בחזרה על RNA Polymerase II מהשיעור הקודם.

ה־CTD ושלבי השעתוק

זנב ה־CTD של Pol II עובר דפוס משתנה של פוספורילציות לאורך השעתוק. השינויים האלה מאפשרים לחלבונים שונים להיקשר לפולימראז בזמן המתאים.

• בתחילת השעתוק ה־CTD כמעט אינו מזורחן.
• לקראת היציאה משלב האיתחול, עולות הפוספורילציות על Ser5 ועל Ser7.
• עם הכניסה להתארכות מתווספת פוספורילציה על Ser2.
• בהמשך יורדות בהדרגה הפוספורילציות על Ser5 ועל Ser7, בעוד שהסימון על Ser2 נשמר ועולים סימונים נוספים. Ser2 ו־Thr4 משתתפים גם בגיוס חלבונים הקשורים ל־splicing.
• בערך ‎180 ‎bp לפני סוף הגן מתרחשת דה־פוספורילציה של Tyr1, המאפשרת גיוס יעיל של פקטורי טרמינציה.

המשמעות היא שה־CTD משמש כפלטפורמה דינמית לגיוס חלבונים של initiation, ‏capping, ‏splicing, ‏elongation ו־termination.

Pol II - פרומוטורים ופקטורי שעתוק

באזור ה־core promoter נקשרים ה־GTFs ‏(General Transcription Factors), ויחד עם Pol II הם יוצרים את ה־PIC ‏(Pre-Initiation Complex), שנקרא גם 43S complex.

באזורים קרובים יותר לפרומוטור, proximal promoter elements, נקשרים פקטורי שעתוק ספציפיים, למשל:

• Sp1 לרצפי GC box.
• NF-Y לרצפי CCAAT box.

רחוק יותר יכולים להימצא אלמנטים רגולטוריים, למשל enhancers. אקטיבטורים שנקשרים אליהם יכולים ליצור קשר עם Mediator, שמסייע בגיוס ובבקרה של מכונת השעתוק בפרומוטור.

Pol II - סדר הרכבת ה־PIC

בפרומוטור המכיל TATA, סדר ההרכבה שהודגש בשיעור הוא:

1. TFIID נקשר לפרומוטור.
2. TFIIB ו־TFIIA נקשרים ומייצבים את הקומפלקס.
3. Pol II מגיע יחד עם TFIIF.
4. TFIIE ו־TFIIH מצטרפים.
5. TFIIH מזרחן את ה־CTD, וכך מאפשר ל־Pol II לעזוב את הפרומוטור ולעבור להתארכות.

לכן, פגיעה בפוספורילציה של Ser5 תפגע קודם כול במעבר מ־initiation ל־elongation.

Promoter-proximal pausing

לאחר תחילת השעתוק, Pol II יכול להיעצר בערך ‎100 ‎bp לאחר ה־TSS. שלב זה נקרא PPP ‏(Promoter-Proximal Pausing).

• NELF ו־Spt5 משתתפים ביצירת העצירה.
• העצירה יכולה להימשך משניות ועד שעות.
• בזמן העצירה מתווסף ה־5′ cap, ונקשרים גם חלבונים שישתתפו בהמשך ב־splicing.
• אם לא מתקבל סיגנל להמשך, השעתוק עלול להיפסק לפני שנוצר תעתיק מלא.
• כאשר מתקבל סיגנל, P-TEFb מזרחן את NELF ואת Spt5. ‏NELF משתחרר, ו־Spt5 מסייע מעתה להתארכות פעילה.

פגיעה בקישור של NELF ל־Spt5 צפויה להפחית את יעילות ה־PPP, אך לא תפגע בהרכבת ה־PIC.

Pol II - טרמינציה

לקראת קצה ה־3′ של הגן, Pol II משעתק את אות הפוליאדנילציה ‏(PAS). ב־RNA האות הוא בדרך כלל:

AAUAAA

האות מגייס את קומפלקס CPA ‏(Cleavage and Polyadenylation Complex), שחותך את ה־RNA ומסייע בהוספת זנב poly(A).

CPA = Cut (cleavage) + Poly-A.

בהמשך, פקטורי טרמינציה, ובהם PNUTS–PP1, גורמים לדה־פוספורילציה של Spt5 ולהאטה הדרגתית של Pol II, עד לשחרורו מה־DNA.

שלושת ה־RNA polymerases באאוקריוטים

שלושת הפולימראזים דומים בליבה המבנית והקטליטית שלהם. ההבדלים המרכזיים ביניהם הם:

• סוגי ה־RNA שהם מסנתזים.
• מבנה הפרומוטורים.
• פקטורי השעתוק שמגייסים אותם.
• מנגנוני הטרמינציה וה־reinitiation.

RNA Polymerase I

RNA Polymerase I מתמחה בשעתוק גני rRNA. הוא מסנתז תעתיק ראשוני ארוך, 47S pre-rRNA, שממנו נוצרים לאחר עיבוד:

• 18S rRNA - חלק מתת־היחידה הקטנה של הריבוזום.
• 5.8S rRNA - חלק מתת־היחידה הגדולה.
• 28S rRNA - חלק מתת־היחידה הגדולה.

ה־5S rRNA מיוצר בנפרד על ידי Pol III.

rRNA מהווה בערך 95–90% מכלל ה־RNA בתא. הכמות הגדולה נדרשת משום שהתא זקוק למספר רב מאוד של ריבוזומים.

Pol I - מבנה כללי

Pol I מורכב מ־13 תת־יחידות ודומה במבנה הבסיסי שלו ל־Pol II. גם לו יש מבנה דמוי “פקמן”, ובו:

• Cleft - הסדק שאליו נכנס ה־DNA.
• Clamp - עוטף ומייצב את ה־DNA בתוך הפולימראז.
• Active site - האתר שבו מתבצעת סינתזת ה־RNA.
• Bridge helix - מסייע להתקדמות הפולימראז לאורך ה־DNA.
• Pore / funnel - דרכו נכנסים הנוקלאוטידים.
• RNA exit channel - התעלה שממנה יוצא ה־RNA החדש.

Pol I - רכיבים ייחודיים

• ב־Pol II, ה־stalk משמש לקישור חלבונים בשלבים רבים של השעתוק ושל עיבוד ה־RNA.
• ב־Pol I, הודגש בעיקר תפקידו בגיוס הפולימראז לתחילת השעתוק.

ב־Pol I התהליכים קורים מהר יותר.

הגרעינון ויצירת ריבוזומים

שעתוק ה־rRNA, עיבודו ותחילת הרכבת הריבוזומים מתרחשים בגרעינון ‏(nucleolus).

הגרעינון הוא אזור בתוך הגרעין ואינו אברון מוקף ממברנה. הוא נראה כהה וצפוף במיקרוסקופ משום שמתרחשת בו פעילות רבה של שעתוק, עיבוד RNA והרכבת קומפלקסים ריבוזומליים.

שלושת אזורי הגרעינון

ריכוז כל המרכיבים באותו אזור משפר את היעילות: גני rDNA, ‏Pol I, פקטורי השעתוק וחלבוני העיבוד והרכבת הריבוזום נמצאים סמוכים זה לזה.

תתי-היחידות של הריבוזום האאוקריוטי

הריבוזום האאוקריוטי השלם הוא 80S, והוא מורכב משתי תתי-יחידות:

האות S מציינת Svedberg unit, מדד לקצב שקיעה בצנטריפוגה. זה אינו מדד שמתחבר באופן חשבוני, ולכן 40S + 60S יוצרים ריבוזום 80S, ולא 100S.

הריבוזום מורכז גם מ־rRNA וגם מחלבונים.

ארגון גני rDNA

גני rDNA קיימים בעותקים רבים, משום שהתא צריך לייצר כמויות גדולות של rRNA. בתא דיפלואידי יש בערך 300 חזרות (עותקים) של יחידת ה־rDNA, אך המספר משתנה בין תאים ובין אנשים. לא כל העותקים פעילים בכל רגע.

באדם, הגנים (DNA) של אותם rRNAs מאורגנים ב־clusters על חמישה כרומוזומים אקרוצנטריים: 13, ‏14, ‏15, ‏21 ו־22. אזורים אלה נקראים NORs ‏(Nucleolus Organizer Regions).

אזורי ה־NOR מכרומוזומים שונים מתקרבים זה לזה במרחב הגרעין. סביבם מתרכזת מכונת השעתוק והעיבוד, וכך נוצר המראה המיקרוסקופי של הגרעינון. משום כך יכולים להופיע בתא כמה גרעינונים, בהתאם לאופן שבו אזורי ה־NOR מתארגנים.

יחידת rDNA חוזרת

גני rDNA מסודרים כ־tandem repeats. כל חזרה היא באורך של כ־43 kb וכוללת:

• אזור מקודד (rRNA genes) באורך של כ־‎13 kb. ממנו נוצר ה־47S pre-rRNA.
• אזור בין־גני רגולטורי, IGS ‏(Intergenic Spacer), באורך של כ־‎30 kb.

בתוך ה־IGS הוזכר גם spacer promoter, שממנו יכול להיווצר תעתיק RNA רגולטורי המשתתף בבקרת יצירת הריבוזומים. מנגנון זה הוזכר בלבד ולא נלמד לעומק.

בחלק מהאיורים או המקורות מופיע 45S pre-rRNA, שהוא תוצר מוקדם של עיבוד ה־47S. לצורך השיעור נשתמש במונח: 47S precursor.

Pol I - איתחול שעתוק

Pol I אינו מזהה את הפרומוטור ואינו מתחיל שעתוק לבדו. תחילה נבנה על פרומוטור ה־rDNA קומפלקס PIC ‏(Pre-Initiation Complex).

UBF

UBF ‏(Upstream Binding Factor) הוא פקטור שעתוק ספציפי שנקשר ל־UCE ולסביבת ה־core promoter.

תפקידיו:

• לזהות את האזור הרגולטורי של גני rDNA.
• לכופף ולארגן את ה־DNA.
• לגייס את SL1.

SL1

SL1 ‏(Selectivity Factor 1) הוא ה־GTF המרכזי של Pol I.

הקומפלקס מכיל:

• TBP ‏(TATA-Binding Protein).
• כמה חלבוני TAF.

למרות שמו של TBP, פרומוטור Pol I אינו חייב להכיל TATA box קלאסי. TBP הוא חלק מהקומפלקס SL1 ומשמש כאן בהקשר אחר.

SL1 מזכיר בהרכבו ובתפקידו את TFIID של Pol II: הוא מסייע בזיהוי הפרומוטור ובגיוס הפולימראז.

TIF-IA / RRN3

TIF-IA, הנקרא גם RRN3, הוא פקטור איתחול שנקשר מראש ל־stalk של Pol I (אזור הגבעול; ב־pol II משמש להרבה, ב־Pol I משמש לצורך הקישור לאזור הפרומוטור).

הוא יוצר את החיבור בין Pol I לבין SL1. מבחינה רעיונית, הוא מזכיר את TFIIF של Pol II: הפקטור מגיע יחד עם הפולימראז ומסייע לגייסו ל־PIC.

Pol I - סדר הרכבת ה־PIC

1. UBF נקשר ל־UCE ולפרומוטור.
2. UBF מגייס את SL1.
3. Pol I מגיע כשהוא קשור ל־TIF-IA/RRN3.
4. TIF-IA/RRN3 מחבר את Pol I ל־SL1.
5. נוצר PIC.
6. Pol I עוזב את הפרומוטור ומתחיל לסנתז את ה־47S pre-rRNA.

ה־PIC של Pol I פשוט יותר מזה של Pol II. בנוסף, חלק מהפעילויות שב־Pol II מסופקות על ידי TFIIE ו־TFIIH כבר משולבות במבנה של Pol I, ולכן ההתחלה יכולה להיות מהירה יותר.

Pol I - התוצר: ‎47S pre-rRNA

Pol I מסנתז תעתיק אחד ארוך, 47S pre-rRNA, המכיל הן את רצפי ה־rRNA הבשלים והן אזורי spacer שיוסרו במהלך העיבוד.

סדר האזורים בתעתיק:

5′ ETS — 18S — ITS1 — 5.8S — ITS2 — 28S — 3′ ETS

ה־ETS וה־ITS אינם חלק מהריבוזום הבשל, אך הם חשובים לעיבוד המדויק של ה־pre-rRNA. הם מספקים רצפים ומבנים שאליהם נקשרים חלבוני עיבוד וקומפלקסים שמבצעים את החיתוכים.

לאחר השעתוק:

1. ה־47S pre-rRNA עובר חיתוכים ועיבוד ב־DFC.
2. נוצרים rRNAs: ‏18S, ‏5.8S ו־28S.
3. ה־rRNA מתחבר לחלבונים ריבוזומליים ב־GC.
4. נבנות תתי-היחידות 40S ו־60S.
5. תתי-היחידות יוצאות בהמשך לציטופלזמה, שם הן משתתפות בתרגום.

Pol I - טרמינציה ואיתחול מחדש

טרמינציה

בסוף כל יחידת rDNA חוזרת נמצאים כמה רצפי Sal box, אליהם נקשר פקטור הטרמינציה TTF-I ‏(Transcription Termination Factor I).

סדר האירועים:

1. Pol I מסיים לשעתק את האזור המקודד ומגיע לאזור הטרמינציה.
2. TTF-I כבר קשור לרצפי ה־Sal box.
3. Pol I נתקל ב־TTF-I ונעצר.
4. PTRF ‏(transcript-release factor) מסייע לשחרר זה מזה את ה־RNA, הפולימראז וה־DNA.
5. השעתוק מסתיים.

Pol I - ‏Reinitiation מהיר

לאחר ש־Pol I משתחרר, UBF ו־SL1 יכולים להישאר קשורים לפרומוטור. לכן אין צורך להרכיב מחדש את כל ה־PIC בכל סבב.

Pol I חדש, הקשור ל־TIF-IA/RRN3, יכול להתחבר במהירות לקומפלקס שכבר נמצא במקום ולהתחיל סבב נוסף.

כך מתקבלים:

• שעתוק חוזר ומהיר של גני rDNA.
• צפיפות גבוהה של מולקולות Pol I על גן פעיל.
• ייצור יעיל של כמויות גדולות של rRNA.

Sal box עוצר; SL1 נשאר.

RNA Polymerase III

RNA Polymerase III משעתק RNAs קצרים שאינם מתורגמים לחלבון.

התוצרים המרכזיים:

Pol III - מבנה כללי

Pol III הוא הגדול מבין שלושת הפולימראזים שנלמדו ומורכב מ־17 תת־יחידות.

הוא שומר על המבנה הבסיסי המשותף:

• cleft לכניסת DNA
• clamp לייצוב DNA
• active site
• bridge helix
• pore לכניסת נוקלאוטידים
• RNA exit channel

Pol III - רכיבים ייחודיים

לכאורה, אין צורך לזכור את שמות כל תתי-היחידות, אך צריך להבין את תפקידי האזורים:

• שני אזורים ב־Pol III יוצרים אינטראקציה עם TFIIIB ומסייעים לגיוס ול־reinitiation.
• הטרודימר נוסף מסייע לטרמינציה (RPC4/5).

Pol III - שלושת סוגי הפרומוטורים

ל־Pol III יש שלושה סוגי פרומוטורים. סוג הפרומוטור תלוי בגן המשועתק:

פירוט בהמשך.

Pol III - פקטורי השעתוק המרכזיים

TFIIIB הוא הפקטור המשותף לכל שלושת סוגי הפרומוטורים, והוא הפקטור שמגייס בסופו של דבר את Pol III.

Type 1 - פרומוטור של 5S rRNA

בגן ל־5S rRNA, הפרומוטור נמצא בתוך האזור המשועתק ונקרא ICR ‏(Internal Control Region).

ה־ICR כולל:

סדר ההרכבה:

1. TFIIIA נקשר ל־C box.
2. TFIIIA מגייס את TFIIIC.
3. TFIIIC נקשר לאזור A box.
4. ה־IE מייצב את הקומפלקס של TFIIIA ו־TFIIIC.
5. TFIIIC מגייס את TFIIIB לאזור upstream ביחס ל־TSS.
6. TFIIIB מגייס את Pol III.
7. מתחיל שעתוק 5S rRNA.

דרך קצרה לזכור:

TFIIIA → TFIIIC → TFIIIB → Pol III

Type 2 - פרומוטור של tRNA

גם בגני tRNA הפרומוטור נמצא בתוך הגן, אך הוא פשוט יותר ואינו זקוק ל־TFIIIA.

הפרומוטור כולל:

• A box
• B box

סדר ההרכבה:

1. TFIIIC נקשר ל־A box ול־B box.
2. TFIIIC מגייס את TFIIIB לאזור upstream של ה־TSS.
3. TFIIIB מגייס את Pol III.
4. מתחיל שעתוק tRNA.

דרך קצרה לזכור:

TFIIIC → TFIIIB → Pol III

Type 3 - פרומוטור של U6 snRNA

בגני U6 הפרומוטור נמצא מחוץ לגן, upstream ל־TSS, ולכן הוא דומה יותר לפרומוטורים של Pol II.

הוא כולל:

סדר ההרכבה:

1. Oct-1 נקשר ל־DSE.
2. Oct-1 מסייע לגייס את SNAPc.
3. SNAPc נקשר ל־PSE.
4. SNAPc מגייס גרסה של TFIIIB המסוגלת להיקשר ל־TATA box.
5. TFIIIB מגייס את Pol III.
6. מתחיל שעתוק U6 snRNA.

קיימת גרסה מעט שונה של TFIIIB בפרומוטור Type 3, אך לא נדרש ללמוד את הרכב תת־היחידות שלה.

Pol III - התארכות, טרמינציה ואיתחול מחדש

נשתמש בגני tRNA כדוגמה המרכזית למחזור השעתוק של Pol III.

Pol III - התארכות

ב־Pol III אין פקטורי התארכות ייעודיים כמו אלה שנלמדו ב־Pol II. הגנים קצרים מאוד, ולכן השעתוק מהיר ואינו דורש מערכת התארכות מורכבת.

בגן tRNA:

1. TFIIIC קשור ל־A box ול־B box.
2. TFIIIB נמצא upstream ומגייס את Pol III.
3. Pol III מתקדם לאורך הגן ומסנתז את ה־tRNA.
4. האינטראקציות של TFIIIC עם ה־DNA יכולות להיפגע זמנית כאשר הפולימראז עובר, אך הקומפלקס אינו מתפרק לחלוטין ונבנה מחדש מיד לאחר המעבר.
5. TFIIIB נשאר במקום ומוכן לגייס פולימראז נוסף.

Pol III - טרמינציה

לכל גני Pol III שנלמדו יש בסוף רצף של T-ים על הגדיל המקודד, שאינו גדיל התבנית:

Coding / non-template DNA:  TTTTTT
Template DNA:               AAAAAA
RNA transcript:             UUUUUU

לכן התעתיק החדש מכיל רצף poly(U).

הקשרים בין U (ב־RNA), לבין A (ב־DNA), חלשים יחסית. כאשר Pol III מגיע לרצף זה, ההיבריד RNA–DNA נעשה בלתי יציב והתעתיק יכול להשתחרר.

ההטרודימר RPC4/5 מסייע בפירוק ההיבריד ובשחרור קומפלקס השעתוק.

ההבחנה בין הגדילים חשובה:

• poly(T) נמצא בגדיל המקודד.
• poly(A) נמצא בגדיל התבנית.
• poly(U) נוצר ב־RNA.

Pol III - ‏Reinitiation מהיר

לאחר הטרמינציה, קומפלקס ה־PIC נשאר ברובו על הגן:

• TFIIIC יכול להישאר קשור לאלמנטים הפנימיים.
• TFIIIB נשאר upstream.
• ה־stalk והקומפלקס הנוסף של Pol III יכולים להיקשר ל־TFIIIB.

לכן, Pol III נוסף יכול להגיע מיד ולהתחיל סבב חדש. מנגנון זה מתאים לייצור מהיר וחוזר של tRNA ושל RNAs קצרים אחרים.

השוואה: Pol I, ‏Pol II ו־Pol III

מה חשוב לדעת מהשיעור

מבנה הפולימראזים

צריך להבין את התפקידים, ולא לשנן את שמות כל תתי-היחידות:

• Cleft - הסדק שאליו נכנס ה־DNA.
• Clamp - עוטף ומייצב את ה־DNA.
• Bridge helix - מסייע למשיכת ה־DNA ולהתקדמות הפולימראז.
• Pore / funnel - מסלול כניסת הנוקלאוטידים.
• RNA exit channel - התעלה שממנה יוצא התעתיק.
• Stalk - תפקידו משתנה בין Pol I, ‏Pol II ו־Pol III.

Pol I

• מסנתז 47S pre-rRNA.
• מה־47S נוצרים rRNAs: ‏18S, ‏5.8S ו־28S.
• 5S rRNA מיוצר על ידי Pol III.
• השעתוק מתרחש בגרעינון.
• להכיר את FC, ‏DFC ו־GC.
• להכיר את UBF, ‏SL1 ו־TIF-IA/RRN3 ואת סדר הרכבת ה־PIC.
• בטרמינציה: Sal boxes, ‏TTF-I ו־transcript-release factor.
• UBF ו־SL1 נשארים בפרומוטור ומאפשרים reinitiation מהיר.

בדיקה עצמית: מה סדר הרכבת ה־PIC של Pol I?

תשובה

1. UBF נקשר ל־UCE ול־core promoter.
2. UBF מגייס את SL1.
3. Pol I מגיע כשהוא קשור ל־TIF-IA/RRN3.
4. TIF-IA/RRN3 מחבר את Pol I ל־SL1.
5. נוצר PIC.

בדיקה עצמית: מה סדר הטרמינציה של Pol I?

Pol III

• מסנתז tRNA, ‏5S rRNA, ‏U6 snRNA ו־RNAs קצרים נוספים.
• להכיר את שלושת סוגי הפרומוטורים:
  • Type 1 - ‏5S rRNA.
  • Type 2 - ‏tRNA.
  • Type 3 - ‏U6 snRNA.
• להבין איזה פקטורים נקשרים בכל סוג ואיך נוצר ה־PIC.
• TFIIIB משותף לכל שלושת הסוגים ומגייס את Pol III.
• אין פקטורי התארכות ייעודיים.
• בטרמינציה: poly(T) בגדיל המקודד, poly(A) ב־template ו־poly(U) ב־RNA.
• ה־PIC שנשאר על הגן מאפשר reinitiation מהיר.

הבחנות שעלו בשאלות החזרה

• ה־cleft הוא הסדק שאליו נכנס ה־DNA.
• clamp שנשאר פתוח יפחית את יציבות קומפלקס השעתוק.
• פוספורילציה של Ser5 חשובה ליציאת Pol II מ־initiation.
• Sp1 הוא פקטור שעתוק ספציפי, לא GTF.
• פגיעה בקישור NELF–Spt5 תפגע ב־PPP.
• דה־פוספורילציה של Tyr1 נדרשת לגיוס פקטורי טרמינציה.
• האירוע הראשון בסיום השעתוק של Pol II הוא זיהוי אות ה־PAS ב־RNA.