שיעור 18 RNA Pol I ו-RNA Pol III

תזכורת: RNA Pol II

השיעור נפתח בחזרה על RNA Polymerase II, כדי לחבר בין מה שנלמד על Pol II לבין Pol I ו־Pol III.

ב־Pol II, הזנב ה־CTD עובר פוספורילציות שונות לאורך השעתוק. דפוס הפוספורילציה מאפשר גיוס של חלבונים שונים בשלבים שונים:

• בשלב ההתחלה (initiation) נוצרת הרכבת ה־PIC על הפרומוטור.
• עם היציאה מהפרומוטור יש פוספורילציה שמאפשרת מעבר להתארכות.
• בתחילת ההתארכות יכולה להתרחש promoter-proximal pausing: הפולימראז כבר התחיל לשעתק, אך נעצר קרוב לפרומוטור עד קבלת סיגנל להמשך.
• בזמן העצירה הזו מתאפשר גם capping של תחילת ה־RNA וגיוס חלבונים שקשורים לעיבוד ה־RNA.
• בסיום השעתוק מזוהה רצף PAS, מתבצע cleavage, מתווסף poly(A), ופקטורי סיום עוזרים לשחרור הפולימראז מה־DNA.

החזרה הזו חשובה משום שב־Pol I ו־Pol III נראה עקרונות דומים: פולימראז לא מתחיל לשעתק לבד, אלא זקוק לפרומוטור, פקטורי שעתוק ו־pre-initiation complex. מצד שני, ב־Pol I ו־Pol III יש קומפלקסים אחרים, פרומוטורים אחרים ותוצרים אחרים.

שלושה RNA polymerases באאוקריוטים

באאוקריוטים יש שלושה סוגים עיקריים של RNA polymerases בגרעין:

שלושת הפולימראזות דומים במבנה הבסיסי שלהן, וחולקים חלק מתתי-היחידות. ההבדלים המרכזיים הם בתוצרים שהם מסנתזים, בפקטורי השעתוק שמגייסים אותם, ובדרך שבה הם מתחילים ומסיימים שעתוק.

RNA Polymerase I

RNA Polymerase I מתמחה בשעתוק גני rRNA. הוא מסנתז precursor ארוך אחד, שנקרא 47S rRNA precursor, ומתוכו נוצרים בהמשך שלושה סוגי rRNA:

• 18S rRNA - חלק מהתת־יחידה הקטנה של הריבוזום
• 5.8S rRNA - חלק מהתת־יחידה הגדולה
• 28S rRNA - חלק מהתת־יחידה הגדולה

ה־5S rRNA אינו מיוצר על ידי Pol I, אלא דווקא על ידי Pol III.

מבנה כללי של Pol I

Pol I דומה במבנהו ל־Pol II: יש לו cleft, clamp, אתר פעיל ותעלות לכניסת DNA ונוקלאוטידים. עם זאת, יש לו כמה מאפיינים ייחודיים.

ב־Pol II, ה־stalk קשור לשלבים רבים לאורך השעתוק ולעיבוד ה־RNA. ב־Pol I התפקיד שלו ממוקד יותר בגיוס פולימראז I דרך TIF-IA/RRN3.

הגרעינון ושעתוק rRNA

שעתוק rRNA ועיבודו מתרחשים בגרעינון (nucleolus). הגרעינון הוא אזור בתוך הגרעין, לא אברון ממברנלי. הוא נראה כהה וצפוף יותר במיקרוסקופ משום שיש בו פעילות גבוהה מאוד של שעתוק, עיבוד והרכבת ריבוזומים.

אפשר לחלק את הגרעינון לשלושה אזורים:

הסיבה שכל התהליכים האלה מרוכזים באותו אזור היא יעילות: התא צריך לייצר הרבה מאוד ריבוזומים, ולכן כדאי לרכז את גני rDNA, את Pol I, את פקטורי השעתוק ואת חלבוני העיבוד והרכבת הריבוזום באותו מרחב גרעיני.

תתי-היחידות של הריבוזום האאוקריוטי

הריבוזום האאוקריוטי השלם הוא 80S, והוא מורכב משתי תתי-יחידות:

האות S מציינת Svedberg unit, כלומר מדד לשקיעה בצנטריפוגה. זה אינו מדד ליניארי למסה, ולכן 40S ו־60S יוצרים יחד ריבוזום 80S ולא 100S.

ארגון גני rDNA

גני rDNA קיימים בעותקים רבים. באדם יש בערך מאות עותקים של גני rDNA, המאורגנים ב־clusters על חמישה כרומוזומים אקרוצנטריים: 13, 14, 15, 21 ו־22. אזורים אלה נקראים NORs - Nucleolus Organizer Regions.

ה־NORs הם המקור המבני של הגרעינון: אזורי rDNA מכרומוזומים שונים מתרכזים באותו אזור בגרעין, ושם נוצרת סביבם מערכת השעתוק והעיבוד של rRNA.

מבנה יחידת rDNA חוזרת

גני rDNA מסודרים כ־tandem repeats. כל יחידה חוזרת כוללת:

• אזור רגולטורי גדול, IGS - Intergenic Spacer.
• אזור מקודד שממנו מסונתז ה־47S rRNA precursor.
• פרומוטור, UCE, אזורי terminator, ולעיתים גם spacer promoter רגולטורי.

היחידה החוזרת היא בערך 43 kb:

במצגת מופיע גם הביטוי 45S ribosomal operon. בשיעור הדגש היה על 47S rRNA precursor. הרעיון זהה לצורך הקורס: יחידת שעתוק ארוכה אחת שממנה נוצרים 18S, 5.8S ו־28S rRNA לאחר עיבוד.

התחלת שעתוק על ידי Pol I

Pol I אינו נקשר לבדו לפרומוטור. כדי להתחיל שעתוק צריך להרכיב PIC - Pre-Initiation Complex על פרומוטור rDNA.

ב־Pol I יש פחות פקטורי שעתוק מאשר ב־Pol II, אך עדיין נדרשת הרכבה מסודרת של קומפלקס.

UBF

UBF - Upstream Binding Factor הוא פקטור שעתוק שנקשר לאזור ה־UCE ול־core promoter של rDNA.

תפקידיו:

• נקשר לאזור הרגולטורי של rDNA
• מכופף ומארגן את ה־DNA כך שהפרומוטור יהיה במבנה מתאים לגיוס פקטורים נוספים
• מגייס את SL1

SL1

SL1 - Selectivity Factor 1 הוא קומפלקס חלבוני שמשמש כ־general transcription factor של Pol I.

הוא כולל:

• TBP - TATA-binding protein
• כמה TAFs

למרות השם “TBP”, אין כאן בהכרח TATA box קלאסי כמו בפרומוטורים רבים של Pol II. זה עדיין אותו רכיב חלבוני שנמצא גם בקומפלקסים אחרים, אבל הוא פועל כאן כחלק מ־SL1.

מבחינה רעיונית, SL1 מזכיר את TFIID של Pol II: הוא עוזר לזהות את הפרומוטור ולגייס את הפולימראז.

TIF-IA / RRN3

TIF-IA, שנקרא גם RRN3, נקשר ל־stalk של Pol I ומאפשר את הקישור בין Pol I לבין SL1.

הרצף הכללי:

1. UBF נקשר ל־UCE ול־core promoter.
2. UBF מגייס את SL1.
3. Pol I מגיע כשהוא קשור ל־TIF-IA/RRN3.
4. TIF-IA/RRN3 עוזר לחבר את Pol I ל־SL1.
5. נוצר PIC וניתן להתחיל שעתוק.

התוצר של Pol I: 47S rRNA precursor

Pol I מסנתז RNA ארוך אחד: 47S rRNA precursor.

ה־precursor כולל אזורים שיישארו כרכיבי rRNA ואזורים שייחתכו החוצה במהלך העיבוד.

מבנה ה־precursor:

ה־ETS וה־ITS אינם נשארים בריבוזום הבשל. הם חשובים לעיבוד נכון של ה־pre-rRNA: הם מספקים מבנים ורצפים שאליהם יכולים להיקשר חלבוני עיבוד ו־snoRNPs, כדי לחתוך ולעבד את ה־RNA בצורה מדויקת.

לאחר השעתוק:

1. ה־47S precursor עובר חיתוכים ושינויים ב־DFC.
2. מתקבלים 18S, 5.8S ו־28S rRNA.
3. ה־rRNA מתחבר לחלבונים ריבוזומליים ב־GC.
4. תתי-היחידות הריבוזומליות עוברות בהמשך לציטופלזמה להשלמת ההרכבה.

סיום שעתוק ו־reinitiation ב־Pol I

בסוף האזור המקודד, אחרי 28S rRNA, יש אזורי טרמינציה. ב־Pol I הטרמינציה תלויה ברצפים שנקראים Sal boxes ובפקטור TTF-I.

הרצף הכללי:

1. Pol I מתקדם מעבר לאזור 28S.
2. TTF-I נקשר ל־Sal box באזור הטרמינציה.
3. הקישור של TTF-I גורם לעצירה של Pol I.
4. PTRF - transcript-release factor מסייע לשחרור ה־RNA והפולימראז.
5. Pol I ניתק מה־DNA ומה־RNA החדש.

Reinitiation

בגני rDNA יש צורך בשעתוק אינטנסיבי מאוד. לכן, לאחר ש־Pol I עוזב את הפרומוטור, חלק מפקטורי ההתחלה יכולים להישאר קשורים לפרומוטור ולשמש כ־reinitiation scaffold.

המשמעות:

• אין צורך לבנות מחדש את כל קומפלקס ההתחלה מאפס בכל סבב.
• Pol I חדש יכול להגיע מהר יותר.
• מתקבלת צפיפות גבוהה של Pol I על גני rDNA פעילים.

זה מתאים לצורך התאי: ייצור רציף ומהיר של rRNA, שממנו נבנים ריבוזומים רבים.

RNA Polymerase III

RNA Polymerase III מתמחה בשעתוק RNAs קצרים ולא מתורגמים.

התוצרים המרכזיים:

מבנה כללי של Pol III

Pol III דומה לפולימראזות האחרים בליבה הקטליטית שלו, אך כולל תוספות שמותאמות לשעתוק מהיר וחוזר של גנים קצרים.

התוצרים של Pol III קצרים מאוד, ולכן השעתוק יכול להיות מהיר. בהרבה מהמקרים ה־PIC נשאר על הגן לאחר סיום שעתוק, וכך Pol III נוסף יכול להגיע במהירות לסבב נוסף.

שלושת סוגי הפרומוטורים של Pol III

ל־Pol III יש שלושה סוגים עיקריים של פרומוטורים. חלקם נמצאים בתוך הגן עצמו, בניגוד למה שמוכר יותר מ־Pol II.

פקטורי השעתוק המרכזיים של Pol III

Type 1 promoter - גני 5S rRNA

בגני 5S rRNA, הפרומוטור נמצא בתוך האזור המשועתק. האזור הזה נקרא ICR - Internal Control Region.

ה־ICR כולל שלושה אלמנטים:

רצף ההרכבה:

1. TFIIIA נקשר ל־C box.
2. TFIIIA מגייס את TFIIIC.
3. TFIIIC נקשר גם לאזור A box.
4. TFIIIC מגייס את TFIIIB לאזור upstream של תחילת השעתוק.
5. TFIIIB מגייס את Pol III.
6. מתחיל שעתוק של 5S rRNA.

Type 2 promoter - גני tRNA

בגני tRNA, גם הפרומוטור נמצא בתוך הגן, אך אין צורך ב־TFIIIA.

האלמנטים המרכזיים:

רצף ההרכבה:

1. TFIIIC נקשר ל־A box ול־B box בתוך הגן.
2. TFIIIC מגייס את TFIIIB לאזור upstream של transcription start site.
3. TFIIIB מגייס את Pol III.
4. מתחיל שעתוק tRNA.

כיוון שגני tRNA קצרים, TFIIIC יכול להישאר קשור לאלמנטים הפנימיים גם בזמן ש־Pol III מתקדם לאורך הגן.

Type 3 promoter - גני U6 snRNA

בגני U6 snRNA, הפרומוטור נמצא מחוץ לגן, upstream לתחילת השעתוק. זה מזכיר יותר את סידור הפרומוטורים של Pol II.

האלמנטים המרכזיים:

רצף ההרכבה:

1. Oct-1 נקשר ל־DSE.
2. Oct-1 מסייע בגיוס SNAPc.
3. SNAPc נקשר ל־PSE.
4. SNAPc מגייס TFIIIB מסוג מתאים, הכולל BRF2.
5. TFIIIB נקשר באזור ה־TATA box ומגייס את Pol III.
6. מתחיל שעתוק U6 snRNA.

התארכות, סיום ו־reinitiation ב־Pol III

השיעור התמקד במיוחד בגני tRNA כדוגמה לאופן שבו Pol III עובד על גנים קצרים.

התארכות

ב־Pol III אין פקטורי elongation ייעודיים כמו ב־Pol II.

הסיבה הפשוטה היא שגני Pol III קצרים מאוד. השעתוק שלהם מהיר, והמערכת מותאמת לייצור חוזר ומהיר של RNAs קצרים.

בגני tRNA:

• TFIIIC נקשר ל־A box ול־B box בתוך הגן.
• TFIIIB מגויס upstream ל־TSS.
• Pol III מגויס על ידי TFIIIB.
• בזמן ש־Pol III מתקדם, הקומפלקס על הפרומוטור נשאר יציב ומאפשר סבבים נוספים.

סיום שעתוק

הטרמינציה של Pol III פשוטה יחסית.

רצף הסיום הוא poly(dT) על הגדיל שאינו template, כלומר על הגדיל המקודד. בהתאם לכך, בגדיל ה־template יש רצף poly(A), וה־RNA החדש מכיל רצף poly(U).

הקשר בין רצף U ב־RNA לבין רצף A ב־DNA חלש יחסית. לכן, כאשר Pol III מגיע לאזור הזה, ה־hybrid בין RNA ל־DNA מתפרק בקלות והתעתיק משתחרר.

RPC4/5 heterodimer מסייע לטרמינציה הזו ומייעל את פירוק קומפלקס השעתוק.

Reinitiation מהיר

בגני tRNA, לאחר סיום שעתוק, TFIIIC ו־TFIIIB יכולים להישאר קשורים לגֵן. לכן Pol III יכול לחזור במהירות לסבב נוסף.

המשמעות:

• הסבב הראשון איטי יחסית, כי צריך להרכיב את קומפלקס ההתחלה.
• בסבבים הבאים הקומפלקס כבר מוכן.
• ייצור tRNA נעשה מהיר ויעיל.

הסבב הראשון יכול לקחת דקות, ואילו סבבים חוזרים יכולים להיות מהירים בהרבה.

טבלת השוואה מסכמת

סיכום התהליכים העיקיים

Pol I:

1. UBF נקשר ל־UCE/core promoter.
2. SL1 נקשר ומארגן את הפרומוטור.
3. Pol I מגיע עם TIF-IA/RRN3.
4. נוצר PIC.
5. Pol I מסנתז 47S rRNA precursor.
6. ה־precursor עובר עיבוד ל־18S, 5.8S ו־28S.
7. TTF-I ו־PTRF משתתפים בטרמינציה.

Pol III:

1. סוג הפרומוטור קובע איזה פקטורים ייקשרו.
2. Type 1: 5S rRNA - TFIIIA ואז TFIIIC ו־TFIIIB.
3. Type 2: tRNA - TFIIIC ואז TFIIIB.
4. Type 3: U6 - Oct-1, SNAPc ואז TFIIIB.
5. TFIIIB מגייס את Pol III.
6. Pol III משעתק גנים קצרים במהירות.
7. poly(dT) מסיים את השעתוק.
8. הקומפלקס שנשאר על הגן מאפשר reinitiation מהיר.

חזרה למבחן

• לדעת איזה פולימראז מסנתז איזה תוצר.
• להבין את ההבדל בין Pol I, Pol II ו־Pol III מבחינת פרומוטורים ופקטורי שעתוק.
• לדעת ש־Pol I מסנתז את 47S rRNA precursor, שמתעבד ל־18S, 5.8S ו־28S.
• לזכור ש־5S rRNA מסונתז על ידי Pol III.
• להבין מהו גרעינון ומהם FC, DFC ו־GC.
• להבין את תפקיד UBF, SL1 ו־TIF-IA/RRN3 ב־Pol I.
• לדעת את שלושת סוגי הפרומוטורים של Pol III: 5S, tRNA ו־U6.
• להבין ש־Pol III מסיים שעתוק באמצעות רצף poly(dT), שמוביל ל־poly(U) בתעתיק ולשחרור ה־RNA.