שיעור 19 עיבוד RNA

עיבוד RNA בזמן שעתוק

בשיעורים הקודמים הוגדרו שלושה פולימראזות עיקריים בגרעין האאוקריוטי: RNA Polymerase I, RNA Polymerase II ו־RNA Polymerase III. בשיעור הנוכחי נתמקד במה שקורה ל־RNA לאחר שהוא מתחיל להיווצר, ובפרט בעיבודו עד לקבלת המבנה הבוגר והפעיל שלו.

כל סוג RNA עובר עיבוד אחר:

ב־mRNA, העיבוד קשור מאוד לשעתוק עצמו. הזנב CTD של Pol II מגייס חלבונים שמבצעים capping, splicing ו־polyadenylation בזמן שה־RNA עדיין יוצא מהפולימראז. לכן השעתוק והעיבוד מתרחשים במקביל ומשפיעים זה על זה.

עיבוד mRNA: שלושת השלבים העיקריים

תעתיק ראשוני של גן המקודד לחלבון נקרא pre-mRNA. הוא כולל אקסונים, אינטרונים וקצוות שעדיין צריכים לעבור עיבוד. כדי להפוך ל־mRNA בוגר, הוא עובר שלושה תהליכים עיקריים:

5′ capping → splicing → polyadenylation

בנוסף לשלושת התהליכים האלה, mRNA יכול לעבור מודיפיקציות כימיות על גבי הנוקלאוטידים עצמם. אלה שינויים בתעתיק עצמו, ולא “תוספת קצה” כמו cap או Poly-A.

בדוגמה מהמצגת רואים את ההבדל בין גן קצר כמו β-globin, שיש בו מעט אקסונים ואינטרונים, לבין גן ארוך כמו Factor VIII, שיש בו 26 אקסונים ו־25 אינטרונים. ככל שיש יותר אינטרונים, תהליך ה־splicing נעשה חשוב יותר ליצירת mRNA מדויק.

5′ capping

5′ cap הוא גואנוזין שעבר מתילציה, המחובר לנוקלאוטיד הראשון של ה־RNA בקשר הפוך וייחודי: 5′-to-5′ triphosphate linkage. הקשר הזה שונה מהקשרים הרגילים בתוך RNA, שבהם נוקלאוטיד אחד מחובר לנוקלאוטיד הבא בכיוון 5′←3′ (חמש לשלוש).

ה־cap מתווסף בתחילת ההתארכות של Pol II, כאשר ה־RNA החדש כבר יצא מעט מהפולימראז. בשלב הזה חלבונים שקשורים ל־CTD ול־SPT5 מגייסים את פקטורי ה־capping.

שלושת האנזימים של capping

בשלב השני, האנזים משתמש ב־GTP. הוא מסיר ממנו שני פוספטים, כך שנשאר GMP, ומחבר אותו ל־RNA. לאחר מכן מתווספות קבוצות מתיל, ולכן ה־cap הבוגר נקרא בדרך כלל m⁷G cap.

תפקידי ה־cap

מודיפיקציות על mRNA

מעבר ל־cap, התעתיק עצמו יכול לעבור מודיפיקציות כימיות. חלק מהן מתווספות תוך כדי שעתוק וחלק לאחר השעתוק. בשיעור לא נדרש לזכור את כל סוגי המודיפיקציות בעל פה, אבל כן חשוב להכיר את העיקרון: שינוי קטן בבסיס או בריבוז יכול להשפיע על יציבות RNA, splicing, export ותרגום.

דוגמאות:

המיקום של מודיפיקציה והאם היא תתווסף לתעתיק מסוים תלויים בהקשר התאי. אותו mRNA יכול לעבור מודיפיקציה בתנאי תא אחד ולא לעבור אותה בתנאי אחר. כך התא יכול להשפיע על אורך חיי ה־RNA, על יציאתו מהגרעין ועל יעילות התרגום שלו.

Polyadenylation וזנב Poly-A

Polyadenylation הוא תהליך עיבוד קצה 3′ של mRNA. בניגוד ל־cap, שנוסף לקצה 5′, כאן התא קובע היכן לחתוך את ה־RNA בקצה 3′ ומוסיף אחר כך זנב ארוך של אדנינים.

האותות שמגדירים את אזור החיתוך וה־polyadenylation מקודדים ב־DNA, אבל הם מזוהים לאחר שהם כבר שועתקו ל־RNA. הרצף המרכזי הוא PAS - Polyadenylation Signal, ובדרך כלל מופיע בו המוטיב AAUAAA.

רצף האירועים

PAP אינו משתמש בתבנית DNA. לכן זנב ה־Poly-A עצמו אינו מקודד ישירות בגנום. הוא מתווסף לאחר החיתוך, בעזרת ATP, ובדרך כלל מגיע לאורך של בערך 200 נוקלאוטידים.

תפקידי Poly-A

Splicing: הוצאת אינטרונים וחיבור אקסונים

Splicing הוא התהליך שבו אינטרונים מוסרים מתוך pre-mRNA, ואקסונים סמוכים מחוברים זה לזה. התוצר הוא mRNA בוגר שבו רצפי האקסונים מסודרים ברצף המתאים למסגרת הקריאה.

האנזים-קומפלקס שמבצע את הספלייסינג נקרא spliceosome. הוא מורכב מ־RNA וחלבונים, ולכן מזכיר מבחינה רעיונית קומפלקסים כמו הריבוזום: לא מדובר רק בחלבון אחד שמבצע תגובה, אלא במכונה מולקולרית גדולה ודינמית.

ה־spliceosome מבצע שלוש פעולות עיקריות:

1. מזהה את גבולות האינטרון.
2. מקרב את האקסון שלפני האינטרון לאקסון שאחריו.
3. מוציא את האינטרון ומחבר את האקסונים.

התהליך מתרחש במקרים רבים תוך כדי שעתוק. Pol II ממשיך לסנתז RNA, ובמקביל חלבוני splicing מגויסים לתעתיק החדש, בין היתר דרך ה־CTD.

רצפי ההכרה של הספלייסינג

כדי להוציא את האינטרון במקום הנכון, התא צריך לזהות שלושה אזורים ב־pre-mRNA:

הרצף הכללי:

AG|GUAAGU.............CU(A)AC........YYYYYY....AG|G

הסימון Y מציין פירימידין, כלומר C או U. האדנוזין ב־branch point הוא זה שייצור בהמשך את מבנה ה־lariat.

הרכבת ה־spliceosome

ה־spliceosome בנוי מ־snRNPs - small nuclear ribonucleoproteins. כל snRNP כולל snRNA וחלבונים. חמשת ה־snRNPs העיקריים הם:

בנוסף ל־snRNPs יש חלבונים נוספים:

סדר ההרכבה

1. U1 נקשר ל־5′ splice site.
2. BBP ו־U2AF נקשרים באזור ה־branch point וה־3′ splice site.
3. U2 מחליף את BBP/U2AF ונקשר ל־branch point.
4. קומפלקס U4/U6 ו־U5 מצטרף.
5. U5 מקרב את האקסונים.
6. U1 ו־U4 עוזבים. U4 מפסיק לעכב את U6.
7. U6 נקשר מחדש באזור 5′ ויוצר יחד עם U2 את הליבה הקטליטית.
8. NTC/NTR מייצבים את המצב הפעיל ומאפשרים את תגובות החיתוך.

ה־ATP משמש בעיקר לשינויי קונפורמציה, לפירוק והרכבה מחדש של אינטראקציות RNA-RNA ו־RNA-חלבון, ולמיחזור רכיבי ה־spliceosome.

שתי תגובות החיתוך וה־lariat

לאחר שה־spliceosome פעיל, מתרחשות שתי תגובות עיקריות:

לאחר החיבור, האינטרון בצורת lariat יפורק בגרעין. רכיבי ה־spliceosome ממוחזרים לשימוש נוסף. באזור החיבור בין שני האקסונים מתווסף EJC, שישמש בהמשך לבקרה על mRNA שעבר splicing.

Alternative splicing

ב־alternative splicing, אותו גן יכול ליצור כמה mRNAs שונים. ההבדל בין ה־mRNAs נובע מבחירה שונה של אקסונים שייכללו בתעתיק הבוגר.

בדוגמה של α-tropomyosin, אותו גן עובר splicing בצורות שונות בתאים שונים:

• תעתיק אחד מתאים לסוגי שריר מסוימים.
• תעתיק אחר מתאים לשריר חלק.
• תעתיקים אחרים נוצרים בפיברובלסטים או בתאי מוח.

כך התא יכול להשתמש באותו גן כדי לייצר איזופורמים שונים של חלבון. זה חוסך צורך בגן נפרד לכל וריאציה של חלבון, ומאפשר התאמה לרקמה, לשלב התפתחותי או למצב פיזיולוגי.

Alternative splicing יכול לכלול:

הבחירה בין אפשרויות splicing מושפעת מרצפי RNA ומחלבוני בקרה שנקשרים אליהם. רצפי splice חזקים מזוהים ביעילות גבוהה יותר, ורצפים חלשים תלויים יותר בפקטורי בקרה.

בקרת איכות, יציאה מהגרעין ו־NMD

mRNA בוגר אינו יוצא מהגרעין רק מפני שהוא סונתז. עליו לשאת סימנים שמראים שהוא עבר עיבוד תקין: cap, זנב Poly-A עם PABPs, חלבונים שנקשרים בזמן splicing, וחלבוני export.

יציאה מהגרעין או פירוק

Nuclear RNA exosome

ה־nuclear RNA exosome הוא קומפלקס חלבוני גדול שמפרק RNA בגרעין. הוא בנוי כמעין תעלה/חבית חלבונית: RNA נכנס אל הקומפלקס, מגיע לתת־יחידות קטליטיות בעלות פעילות RNase, ומתפרק לנוקלאוטידים.

ה־exosome מפרק בין היתר:

• אינטרונים שנחתכו החוצה.
• RNAs לא בשלים.
• שברי RNA.
• תעתיקים שלא עברו עיבוד תקין.

Nonsense-mediated decay (NMD)

גם אחרי export לציטוזול יש בקרת איכות. אחת הבקרות שנלמדו היא Nonsense-mediated decay, או NMD. היא מזהה mRNA שבו יש stop codon מוקדם, מצב שעלול ליצור חלבון קצר ולא תקין.

הרעיון:

1. לאחר splicing, אזורי חיבור אקסון-אקסון מסומנים על ידי EJC.
2. לאחר export, ריבוזום מבצע סריקה/תרגום ראשון של ה־mRNA.
3. אם מסגרת הקריאה תקינה, הריבוזום עובר לאורך ה־mRNA ומסיר את ה־EJCs.
4. אם יש stop codon מוקדם, הריבוזום נעצר לפני שהוא הסיר EJC שנמצא downstream.
5. EJC שנשאר על mRNA אחרי עצירה מוקדמת מגייס חלבוני Upf ומפעיל פירוק של ה־mRNA.

עיבוד rRNA והרכבת ריבוזומים

החלק השני של השיעור עובר ל־rRNA. בשיעור הקודם נלמד ש־Pol I מסנתז precursor ארוך של rRNA בגרעינון. בשיעור הזה הושלם מה קורה ל־precursor הזה לאחר השעתוק.

מה־47S precursor ל־rRNA בוגר

Pol I מסנתז 47S pre-rRNA. התעתיק הזה כולל את הרצפים שמהם ייווצרו:

• 18S rRNA - חלק מהתת־יחידה הקטנה של הריבוזום.
• 5.8S rRNA - חלק מהתת־יחידה הגדולה.
• 28S rRNA - חלק מהתת־יחידה הגדולה.

בין הרצפים האלה נמצאים spacers:

חשוב להבדיל בין spacers ב־rRNA לבין אינטרונים ב־mRNA. כאן מדובר באזורים שנמצאים בתוך precursor של rRNA ומוסרים בתהליך עיבוד ריבוזומלי.

רצף העיבוד:

ה־18S עובר מסלול עיבוד שמוביל לתת־היחידה הקטנה 40S. ה־5.8S וה־28S מעובדים יחד עם 5S rRNA, שמיוצר על ידי Pol III, ויחד הם משתתפים ביצירת התת־יחידה הגדולה 60S.

מודיפיקציות rRNA

rRNA מכיל הרבה מודיפיקציות. שתי מודיפיקציות שהוזכרו במיוחד:

מודיפיקציות rRNA חשובות לקיפול, יציבות והרכבת ריבוזום פעיל. הן מתרחשות כחלק מתהליך הביוגנזה של הריבוזום בגרעינון.

הרכבת הריבוזום דורשת את שלוש הפולימראזות

הרכבת הריבוזום משלבת כמה מקורות:

חלבוני הריבוזום מסונתזים בציטופלזמה, כי הם תוצרי תרגום של mRNAs. לאחר מכן הם חוזרים לגרעין בעזרת NLS - Nuclear Localization Signal, מגיעים לגרעינון, ונקשרים ל־rRNA תוך כדי עיבודו.

הריבוזום אינו יוצא מהגרעין כ־rRNA חופשי. תתי-היחידות נבנות בהדרגה בגרעינון, עוברות שלבי maturation נוספים, ואז יוצאות בנפרד לציטופלזמה. שם, בזמן תרגום, תת־היחידה הקטנה ותת־היחידה הגדולה מתחברות על גבי mRNA.

עיבוד tRNA

החלק האחרון של השיעור עוסק ב־tRNA. Pol III מסנתז pre-tRNA, שאינו מוכן מיד לתרגום. כדי להפוך ל־tRNA בוגר הוא צריך לעבור חיתוך קצוות, הוספת CCA ומודיפיקציות רבות.

שלבי עיבוד tRNA

רצף CCA בקצה 3′ הוא אתר הקישור של חומצת האמינו. לכן הוא חיוני לתפקיד של tRNA בתרגום. האנזים שמוסיף אותו אינו צריך תבנית DNA; הוא מוסיף C, C ואז A בצורה אנזימטית.

מודיפיקציות tRNA

tRNA הוא אחד מסוגי ה־RNA שעוברים הכי הרבה מודיפיקציות. חלקן עוזרות לייצב את המבנה התלתני, וחלקן משפיעות על זיהוי קודון-אנטיקודון.

דוגמאות שהוזכרו:

Inosine חשוב במיוחד לקריאת קודונים. הוא נוצר כאשר אדנוזין עובר דה־אמינציה, כלומר הסרת קבוצת אמינו והחלפה שלה בחמצן. שינוי כזה מאפשר ל־tRNA לקרוא יותר מאפשרות אחת בקודון, בעיקר בעמדת wobble.