מושגי יסוד
תפקיד האנזים
- אנזימים מזרזים תגובות על ידי הורדת אנרגיית האקטיבציה, אך אינם משפיעים על שיווי המשקל.
- אם $\Delta \text{G}$ של התגובה שלילי - התגובה ספונטנית ויכולה להתרחש גם ללא אנזים, רק לאט יותר.
- האנזים מאפשר להגיע לשיווי משקל מהר יותר, אך לא משנה את $K_{eq}$ (קבוע שיווי המשקל).
- אנזימים יכולים להאיץ תגובות פי $10^7$ עד $10^{14}$.
מנגנוני זירוז
- אינטראקציות לא קוולנטיות - קשרי מימן, אינטראקציות יוניות, כוחות ואן דר ואלס
- קשרים קוולנטיים - קישור לחומצות אמינו ספציפיות או ליונים
- קירוב פיזי - בין שני סובסטרטים או בין הסובסטרט לאנזים
מצב המעבר (Transition State)
- האתר הפעיל של האנזים מותאם לסובסטרט במצב המעבר, לא למצב ההתחלתי.
- התאמה זו היא שמורידה את אנרגיית האקטיבציה.
משוואת מיכאליס-מנטן
המודל הבסיסי
\[\text{E} + \text{S} \underset{k_{-1}}{\stackrel{k_1}{\rightleftharpoons}} \text{ES} \stackrel{k_2}{\longrightarrow} \text{E} + \text{P}\]הנחות המודל
- $k_2 \ll k_{-1}$ (ההנחה במקרה פרטי)
- $k_2$ הוא השלב מגביל המהירות $\text{(rate-limiting step)}$
- מצב יציב (Steady State): $\frac{d\left[\text{ES}\right]}{dt} \approx 0$
משוואת מיכאליס-מנטן
\[V_0 = \frac{V_{\text{max}} \cdot \left[\text{S}\right]}{K_{\text{m}} + \left[\text{S}\right]}\]הגדרת $K_{\text{m}}$
\[K_{\text{m}} = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}\]הגדרה: $K_{\text{m}}$ הוא ריכוז הסובסטרט שבו מגיעים ל-$\frac{1}{2}V_{\text{max}}$.
מקרה פרטי: כאשר $k_2 \ll k_{-1}$ (כלומר, פירוק קומפלקס ES חזרה לסובסטרט מהיר יותר מהפיכתו לתוצר):
\[K_{\text{m}} \approx \frac{k_{-1}}{k_1} = K_d\]במקרה הזה, $K_{\text{m}}$ מהווה מדד לאפיניות - ככל ש-$K_{\text{m}}$ נמוך יותר, האפיניות גבוהה יותר.
הקבוע הקטליטי ($k_{\text{cat}}$)
\[k_{\text{cat}} = \frac{V_{\text{max}}}{\left[\text{E}\right]_{total}}\]יחידות: $\text{sec}^{-1}$ או $\text{min}^{-1}$
משמעות: כמה מולקולות סובסטרט הופכות לתוצר ביחידת זמן על ידי מולקולת אנזים אחת (כאשר האנזים רווי בסובסטרט).
Specificity Constant
\[\frac{k_{\text{cat}}}{K_{\text{m}}}\]יחידות: $\mathrm{M}^{-1} \cdot \mathrm{sec}^{-1}$
משמעות: מדד ליעילות ולספציפיות של האנזים. הערך המקסימלי הוא $10^8 - 10^9$ (גבול הדיפוזיה).
משוואת Lineweaver-Burk
המשוואה
\[\frac{1}{V_0} = \frac{K_{\text{m}}}{V_{\text{max}}} \cdot \frac{1}{\left[\text{S}\right]} + \frac{1}{V_{\text{max}}}\]המשוואה הזאת היא משוואת קו ישר מהצורה $(y = ax + b)$:
| פרמטר | משמעות |
|---|---|
| $y$ | $\frac{1}{V_0}$ |
| $x$ | $\frac{1}{\left[\text{S}\right]}$ |
| שיפוע | $\frac{K_{\text{m}}}{V_{\text{max}}}$ |
| חיתוך עם ציר $Y$ | $\frac{1}{V_{\text{max}}}$ |
| חיתוך עם ציר $X$ | $-\frac{1}{K_{\text{m}}}$ |
מעכבים (Inhibitors)
מעכב תחרותי (Competitive Inhibitor)
- נקשר לאתר הפעיל של האנזים (מתחרה עם הסובסטרט)
- הפיך - ריכוז גבוה של סובסטרט יתגבר על העיכוב
- $V_{\text{max}}$ לא משתנה
- $K_{\text{m}}$ עולה
(apparent $K_{\text{m}} = \alpha \cdot K_{\text{m}}$)
מעכב לא-תחרותי (Uncompetitive Inhibitor)
- נקשר רק לקומפלקס $\text{ES}$ (לא לאנזים חופשי)
- $V_{\text{max}}$ יורד
- $K_{\text{m}}$ יורד
הסבר: כאשר המעכב נקשר ל-$\text{ES}$, הוא מוריד את ריכוז ה-$\text{ES}$. לפי עקרון לה-שטלייה, התגובה $\text{E} + \text{S} \rightleftharpoons \text{ES}$ נדחפת ימינה, מה שמוריד את ה-$K_{\text{m}}$ האפקטיבי.
מעכב מעורב (Mixed Inhibitor)
- יכול להיקשר גם לאנזים חופשי (E) וגם לקומפלקס ES
- $V_{\text{max}}$ יורד
- $K_{\text{m}}$ יכול לעלות או לרדת (תלוי ביחס בין $\alpha$ ל-$\alpha’$)
מקרה פרטי - Non-competitive: כאשר $\alpha = \alpha’$:
- $V_{\text{max}}$ יורד
- $K_{\text{m}}$ לא משתנה
מעכב בלתי הפיך (Irreversible Inhibitor)
- נקשר באופן קוולנטי לאנזים
- אי אפשר להסירו - הפעילות לא חוזרת
- הגרף מראה ירידה לינארית בפעילות עם עליית ריכוז המעכב
שאלה 1
נתונים
אנזים אחד מקטלז את הריאקציה שבה נהפך:
- גלוקוז ← תרכובת B
- מנוז ← תרכובת C
בשתי הריאקציות: $k_2 \ll k_{-1}$
| $\left[\text{S}\right] \, \mathrm{(M)}$ | $V_0$ גלוקוז (μmol/min) | $V_0$ מנוז (μmol/min) |
|---|---|---|
| $1 \times 10^{-5}$ | 150 | 82 |
| $2 \times 10^{-5}$ | 256 | 150 |
| $5 \times 10^{-5}$ | 454 | 320 |
| $1 \times 10^{-4}$ | 600 | 454 |
| $3 \times 10^{-4}$ | 770 | 670 |
| $5 \times 10^{-4}$ | 818 | 750 |
סעיף א’: מה ניתן להסיק לגבי $V_{\text{max}}$, $K_{\text{m}}$ וקבוע הדיסוציאציה?
פתרון
לגבי קבוע הדיסוציאציה:
מכיוון ש-$k_2 \ll k_{-1}$, אז:
\[K_{\text{m}} = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1} \approx \frac{k_{-1}}{k_1} = K_d\]לכן, במקרה זה $K_{\text{m}}$ מהווה מדד לאפיניות (קבוע הדיסוציאציה).
חישוב $V_{\text{max}}$ ו-$K_{\text{m}}$ בשיטת Lineweaver-Burk:
ממשוואת הקו הישר (לגלוקוז):
\[y = 1 \times 10^{-7}x + 0.0011\]חישוב $V_{\text{max}}$:
נקודת חיתוך עם ציר Y (כאשר $x=0$):
\[\frac{1}{V_{\text{max}}} = 0.0011\]מכאן:
\[\boxed{V_{\text{max}} = \frac{1}{0.0011} \approx 909 \text{ μmol/min}}\]חישוב $K_{\text{m}}$:
- נקודת חיתוך עם ציר X (כאשר $y=0$): $-\frac{1}{K_{\text{m}}}$
- מהצבה: $0 = 1 \times 10^{-7}x + 0.0011$
- $x = -11,000$
- $K_{\text{m}} = \frac{1}{11,000} \approx 9.1 \times 10^{-5}\,\mathrm{M} = 1 \times 10^{-4} \,\mathrm{M}$
שיטה חלופית למציאת $K_{\text{m}}$ (למנוז):
לשני הסובסטרטים אותו $V_{\text{max}}$ - כי אותו אנזים, אז:
\[V_{\text{max}} \approx 910 \quad \mathrm{μmol/min}\]נוכל למצוא את $K_{\text{m}}$ עבור מנוז על ידי מציאת הריכוז שבו מתקבל חצי מ-$V_{\text{max}}$:
\[\frac{1}{2}V_{\text{max}} = 455 \, \mathrm{μmol/min}\]מהטבלה: ב-$\left[\text{S}\right] = 1 \times 10^{-4} \, \mathrm{M}$ מקבלים:
\[V_0 = 454 \, \mathrm{μmol/min}\]לכן:
\[\boxed{K_{\text{m}}(\text{manose}) = 1 \times 10^{-4} \, \mathrm{M}}\]סעיף ב’: חישוב Turnover Number
נתון: בתערובת הריאקציה יש $2 \, \mathrm{μmol}$ אנזים.
פתרון:
\[k_{\text{cat}} = \frac{V_{\text{max}}}{\left[\text{E}\right]_{total}} = \frac{909 \, \mathrm{μmol/min}}{2 \, \mathrm{μmol}} = 454.5 \, \mathrm{min}^{-1}\]שאלה 2
נתונים
- חומר TLCK מעכב את הפעילות של פרוטאזה X
- דוגמאות המכילות $14 \, \mathrm{mg}$ של X טופלו ב-TLCK בריכוזים שונים
- הניסוי בוצע בריכוז סובסטרט פי 40 מה-$K_{\text{m}}$
| $\left[\text{I}\right] \, \mathrm{(mM)}$ | Activity ($\mathrm{μmol/min}$) |
|---|---|
| $0$ | $8.1$ |
| $0.2$ | $6.2$ |
| $0.4$ | $4.3$ |
| $0.6$ | $2.4$ |
| $0.7$ | $1.4$ |
| $0.8$ | $0.49$ |
סעיף א’: סוג המעכב
תשובה: ה) Irreversible Inhibitor (מעכב בלתי הפיך)
הסבר: הגרף מראה ירידה לינארית בפעילות עם עליית ריכוז המעכב. זהו מאפיין של מעכב בלתי הפיך - כל מולקולת מעכב שנקשרת מוציאה מולקולת אנזים מפעילות באופן קבוע.
סעיף ב’: המשקל המולקולרי של X
פתרון:
- נקודת החיתוך עם ציר X (כאשר Activity = 0): $[\text{I}] = 0.85 \, \mathrm{mM}$
- בנקודה זו, כל האנזים נקשר למעכב, לכן: $[\text{I}] = \left[\text{E}\right]_{total}$
- ריכוז האנזים = $0.85 \, \mathrm{mM} = 0.85 \, \mathrm{μmol/mL}$
נתון: מסת האנזים = $14 \, \mathrm{mg}$
\[\mathrm{MW} = \frac{\text{mass}}{\text{mols}} = \frac{14 \text{ mg}}{0.85 \text{ μmol}} = \frac{14,000 \text{ μg}}{0.85 \text{ μmol}} \approx 16,470 \text{ Da}\]תשובה: ב) 16,470 דלטון
סעיף ג’: Turnover Number של X
פתרון:
- הניסוי בוצע בריכוז סובסטרט פי 40 מה-$K_{\text{m}}$
- זה אומר שאנחנו ב-$V_{\text{max}}$ (ריכוז סובסטרט גבוה מאוד מעל ה-$K_{\text{m}}$)
- לכן, הפעילות ללא מעכב $(8.1 \, \mathrm{μmol/min})$ שווה ל-$V_{\text{max}}$
תשובה: א) $9.5 \, \mathrm{min}^{-1}$
סיכום נוסחאות חשובות
| פרמטר | נוסחה | משמעות |
|---|---|---|
| $K_{\text{m}}$ | $\frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$ | ריכוז סובסטרט ב-$\frac{1}{2}V_{\text{max}}$ |
| $k_{\text{cat}}$ | $\frac{V_{\text{max}}}{\left[\text{E}\right]_T}$ | Turnover number |
| $\frac{k_{\text{cat}}}{K_{\text{m}}}$ | - | Specificity constant |
| $V_0$ | $\frac{V_{\text{max}}\left[\text{S}\right]}{K_{\text{m}} + \left[\text{S}\right]}$ | מהירות התגובה |
סיכום השפעת מעכבים
| סוג מעכב | $V_{\text{max}}$ | $K_{\text{m}}$ | חיתוך Y | חיתוך X |
|---|---|---|---|---|
| תחרותי | ללא שינוי | ↑ | ללא שינוי | משתנה |
| לא-תחרותי | ↓ | ↓ | משתנה | משתנה |
| מעורב | ↓ | ↑ או ↓ | משתנה | משתנה |
| Non-competitive | ↓ | ללא שינוי | משתנה | ללא שינוי |
| בלתי הפיך | ירידה לינארית בפעילות עם עליית $\left[\text{I}\right]$ |