שיעור 6 מזלג רפליקציה, טלומרים וטופואיזומרז

תוכן העניינים:

1. חזרה על השיעור הקודם
2. ראשית הכפלה - Origin of Replication
3. יצירת מזלג הכפלה
4. מרכיבי מזלג הרפליקציה
5. מקטעי אוקזקי
6. סגירת מקטעי אוקזקי - החלפת הפריימר
7. Fragile X ומחלות Trinucleotide Repeat
8. מחלות Trinucleotide Repeat
9. סיכום מזלג הרפליקציה - תהליך שלם

חזרה על השיעור הקודם

בשיעור הקודם דיברנו על DNA פולימרז. הסינתזה היא תהליך ספונטני מבחינה כימית, כיוון שהנוקלאוטיד נושא את האנרגיה הדרושה בקבוצת הטרי-פוספט שלו. הסינתזה מתבצעת תמיד בכיוון 5’←3’: הנוקלאוטיד החדש מתחבר לקבוצת ההידרוקסיל החופשית שעל פחמן 3’ של הגדיל הגדל. לא קיימת שום מערכת ביולוגית שבה הסינתזה הולכת בכיוון הפוך. בנוסף לכך, DNA פולימרז יודע רק להאריך שרשראות קיימות ואינו יכול להתחיל שרשרת חדשה de novo, בניגוד ל־RNA פולימרז.

תכונת ה־Proofreading (הגהה)

ל־DNA פולימרז שני אתרים פעילים:

• האתר הראשון - פולימריזציה: האפיניות לכל הנוקלאוטידים זהה, ומה שקובע איזה נוקלאוטיד יסונתז הוא זיווג הבסיסים עם הטמפלייט. נוקלאוטיד נכון יוצר קשרי מימן עם הטמפלייט, מה שגורם לשינוי קונפורמציה שמקרב את קצה 5’ של הנוקלאוטיד לקבוצת ה־OH של השרשרת הגדלה ומאפשר את הפולימריזציה.

  

• האתר השני - אקסונוקלאז 3’←5’: יודע לפרק נוקלאוטיד אחד מקצה המולקולה. האפיניות שלו גבוהה לחד־גדיל בלבד. כשנכנס נוקלאוטיד שגוי, הוא חוזר במהרה לקונפורמציית האנרגיה הנמוכה שלו, הדו־גדיל “נפתח” מקומית, וה־DNA פולימרז קופץ לאתר האקסונוקלאז ומסלק את הנוקלאוטיד השגוי.

נקודה קלינית: קיים שיווי-משקל עדין בין קצב הפולימריזציה לקצב פעילות האקסונוקלאז. מוטציה שמגבירה את קצב הפולימריזציה תאיץ את הרפליקציה אך תגדיל את אחוז הטעויות. מוטציה שמבטלת את הפעילות האקסונוקלאזית תטה את שיווי המשקל לכיוון טעויות מוגברות. לאחר סיום הרפליקציה פועלת גם מערכת תיקון נוספת (post-replication repair) שתדון בהמשך הקורס.

ראשית הכפלה - Origin of Replication

אזורי ראשית הכפלה (Origins of Replication) מפוזרים לאורך הכרומוזום ומתאפיינים במספר תכונות פיזיקליות שמקלות על פתיחת הדו־גדיל:

• עשיר ב־AT: לזיווג A-T יש רק שני קשרי מימן (לעומת שלושה לזיווג G-C), ולכן קל יותר לפתוח אותו. בנוסף, רצפי A ארוכים יוצרים כיפוף (Bent) של הדו־גדיל, שמסייע ליצירת לולאה ומקל על הפתיחה.
• ללא נוקלאוזומים (Nucleosome-free): הנוקלאוזומים מוסרים מהאזור באופן אקטיבי על־ידי קומפלקסי remodeling. הנוקלאוזומים שכן קיימים בסמוך לאתר תורמים למתח פיתולי שלילי (negative supercoiling) המרפה את קשרי הגדיל.
• Negative supercoiling: המתח הפיתולי השלילי שנוצר בין נוקלאוזומים סמוכים מחליש את קשרי הגדיל ומקל מאוד על פתיחת הדו־גדיל.

השוואה: חיידקים מול תאים אאוקריוטים

בחיידק E. coli יש אתר ראשית הכפלה אחד בלבד, ממנו הרפליקציה מתקדמת בשני כיוונים. מכיוון שהגנום הוא $4.6 \, \mathrm{Mb}$ וקצב הפולימרז הוא $1,000$ בסיסים/שנייה, החישוב התיאורטי נותן בערך $40$ דקות - אך בפועל E. coli מסוגל להשלים את הרפליקציה תוך 20 דקות, בגלל שהוא מתחיל מחזור רפליקציה חדש עוד לפני שסיים את הקודם (“re-firing”).

באאוקריוטים, לעומת זאת:

• הגנום האנושי גדול בסדרי גודל מגנום חיידקי.
• קצב ה־DNA פולימרז הוא רק כ־50 בסיסים/שנייה.
• אסור לאתר ראשית הכפלה “לירות” יותר מפעם אחת בכל מחזור תא.
• הפתרון: אתרי ראשית הכפלה רבים שיורים במקביל לאורך כל כרומוזום. לא כולם יורים בו־זמנית - יש early origins ו־late origins, בהתאם למצב הכרומטין, לתעתוק פעיל ועוד.

יצירת מזלג הכפלה

עוברים למצגת 6.

הרכבת מזלג הרפליקציה

תהליך הרכבת המזלג בתאים אאוקריוטים:

1. ORC (Origin Recognition Complex) - נקשר לאתר ראשית הכפלה מיד עם סיום המיטוזה, בתחילת G1. זהו ה”סמן” של האתר.
2. ה־ORC מגייס את MCM (Mini Chromosome Maintenance) - קומפלקס הליקאז שנשאר לא־פעיל, “נטען” על ה־DNA בשלב G1 בנוכחות גורמי בקרה CDC6 ו־CDT1.
3. בכניסה לשלב S, קסקדה של פוספורילציות ודה־פוספורילציות (בהשתתפות CDC45 ו־SLD3) משחררת את ה־MCM מה־ORC ומפעילה אותו.
4. ה־MCM מנצל את הפתיחה הראשונית שנוצרה באתר ה־ORC ומתחיל לפתוח את הדו־גדיל.

מה שחשוב לזכור: ה־ORC מסמן את האתר ← קושר MCM ← קסקדת פוספורילציה משחררת ומפעילה את ה־MCM ← האתר “יורה”.

ההליקאז - MCM

ההליקאז (MCM) הוא אנזים שמבצע “התכה” - פתיחת הדו־גדיל לשני חד־גדילים. מקור האנרגיה: הידרוליזה של ATP (ATP → ADP). ההליקאז מתגבר על קשרי המימן ועל קשרי ון-דר-ואלס שמחזיקים את הדו־גדיל, ובנוסף:

• מפרק מבנים שניוניים (טריפלקסים, קוואדרופלקסים, לולאות G4).
• מסלק חלבונים שיושבים על ה־DNA (RNA פולימרז, היסטונים ועוד) - פועל כ”מכבש” שנכנס עם אנרגיה גבוהה ומפנה הכל מפניו.

משפחת ההליקאזות היא אחת הגדולות ביותר בתא, ויש לה תפקידים גם ב־DNA repair, בטרנסקריפציה ובסגירת ג’נקשיונים של הולידאי.

טופואיזומרז - שחרור מתח הסופרקוילינג

פתיחת הדו־גדיל על־ידי ההליקאז יוצרת positive supercoiling מלפנים. אם המתח הזה לא יוסר, הוא יתנגד לפעולת ההליקאז ועלול לעצור אותו או לגרום לשבירת ה־DNA. טופואיזומרז מסיר את המתח הזה על־ידי שינוי ה־linking number של ה־DNA, ופעילותו חיונית לקידום הרפליקציה.

מרכיבי מזלג הרפליקציה

DNA פולימרז אלפא (פרימאז)

DNA פולימרז אינו יכול להתחיל שרשרת חדשה. לכן נדרש פריימר - קצה $\ce{3’-OH}$ קיים שממנו ניתן להמשיך. בחיידקים, האנזים שמסנתז פריימרים הוא פרימאז; באאוקריוטים זהו DNA פולימרז אלפא.

תכונות DNA פולימרז אלפא:

• יודע להתחיל שרשראות de novo.
• מסנתז תחילה כ־8–10 ריבונוקלאוטידים (RNA), ואז ממשיך בעוד כ־10–20 דאוקסיריבונוקלאוטידים (DNA) - סך הכול כ־20–30 נוקלאוטידים.
• פרוססיביות נמוכה מאוד - נופל אחרי סיום הפריימר.
• פידליטי נמוך - אין לו מנגנון proofreading (הפריימר הוא מולקולה זמנית שתוחלף בהמשך).

RPA / SSB - Single-Strand Binding Protein

לאחר פתיחת הדו־גדיל, ה־DNA החד־גדילי עלול להיסגר חזרה. RPA (באאוקריוטים) / SSB (בחיידקים) מצפים את ה־DNA החד־גדילי, ממסכים את הבסיסים ומונעים היווצרות מחדש של הדו־גדיל. כך נשמרת “בועת ההכפלה” פתוחה.

Processivity - ה־Sliding Clamp (PCNA)

ה־DNA פולימרז הרפליקטיבי (Pol ε ו־Pol δ) חייב לסנתז מיליוני בסיסים בלי ליפול. הדבר מושג על־ידי PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) - חלבון בצורת טבעת שנועלת פיזית את ה־DNA פולימרז על ה־DNA.

מנגנון הפעולה:

1. קישור של ATP גורם לפתיחת הטבעת.
2. ה־PCNA מתיישב על ה־DNA עם ה־DNA פולימרז בתוכו.
3. הידרוליזה ATP ← ADP סוגרת את הטבעת.
4. ה־DNA פולימרז נעול ואינו יכול ליפול - פרוססיביות גבוהה מאוד.

גם אם ה־DNA פולימרז מתנתק רגעית מהתבנית, ה־PCNA מחזיק אותו קרוב ומאפשר לו לחזור ולהמשיך. דומה קונספטואלית לקוהיזין.

מקטעי אוקזקי

מכיוון שסינתזה של DNA חייבת להיות בכיוון 5’←3’, ואחד משני גדילי הטמפלייט פונה בכיוון 3’←5’ ביחס לכיוון התקדמות המזלג - הגדיל הזה (ה-lagging strand) לא יכול להיות מסונתז בצורה רציפה. הפתרון: מקטעי אוקזקי - סינתזה מקוטעת על־ידי היפוך מקומי של ה־lagging strand במזלג הרפליקציה, ליצירת אוריינטציה 5’←3’ זמנית.

מה קובע את גודל מקטעי אוקזקי?

• בחיידקים: 1,000–2,000 נוקלאוטידים (אין נוקלאוזומים).
• באדם ובתאים אאוקריוטים: 100–200 נוקלאוטידים - הגודל מוגבל על־ידי גודל הנוקלאוזום (147 נ”ק + לינקר ≈ 200 נ”ק).

נקודה קלינית: כל ערך בין 100 ל־200 נוקלאוטידים בהקשר של ביולוגיה מולקולרית - חשוב לחשוב מיד על גודל נוקלאוזום אחד. למשל, ה־circulating cell-free DNA בדם נמצא גם הוא בסדר גודל זה.

DNA פולימרז רפליקטיבי עוצר כאשר הוא נתקל באזור דו־גדילי - כלומר בפריימר של מקטע האוקזקי הבא. זו הנקודה שבה נוצר nick (שבר חד־גדילי) ומתחיל תהליך החלפת הפריימר.

סגירת מקטעי אוקזקי - החלפת הפריימר

בחיידקים - E. coli DNA Polymerase I, פעילות 5’←3’ אקסונוקלאז

ב־E. coli, DNA פולימרז I (הראשון שבודד על־ידי ארתור קורנברג ב־1958) הוא לא הפולימרז הרפליקטיבי - הוא בעל פרוססיביות נמוכה יחסית. תפקידו הייחודי: יש לו פעילות אקסונוקלאז 5’←3’ בנוסף לפולימרז ולאקסונוקלאז 3’←5’. כלומר: הוא מפרק מלפניו ומסנתז מאחוריו בו־זמנית, ובכך:

1. מפרק את הפריימר (RNA + DNA בדיוק נמוך).
2. מחליף אותו ב־DNA בדיוק גבוה.
3. לבסוף, DNA ליגאז (עם אנרגיה מ־ATP) סוגר את ה־nick האחרון.

באאוקריוטים - FEN1 (Flap Endonuclease)

באאוקריוטים, ל־DNA פולימרז δ יש פעילות חלקית של הליקאז, ולכן כאשר הוא מגיע לפריימר של המקטע הבא, הוא דוחף את הפריימר הישן ויוצר flap - חד־גדיל שמסתדר כלפי חוץ. ה־FEN1 (Flap Endonuclease 1) (וגם DNA2) חותכים את ה־flap הזה, ואז DNA פולימרז ממלא את הפער, וליגאז סוגר את ה־nick.

ההבדל:

• בחיידקים - אקסונוקלאז 5’←3’ של Pol I
• באאוקריוטים - אנדונוקלאז (FEN1) שחותך לאחר יצירת flap.

Fragile X ומחלות Trinucleotide Repeat

כרומטיניזציה לאחר הרפליקציה

מיד לאחר מעבר מזלג הרפליקציה, ה־DNA החשוף נארז חזרה לכרומטין על־ידי קומפלקס FACT. חלק מהיסטונים ממוחזרים (מהגדיל הישן) וחלק חדשים (שהסינתזה שלהם מוגברת בשלב S). תהליך האריזה מוסיף סמנים אפיגנטיים שמאפשרים להבדיל בין הגדיל הישן לחדש - מידע חיוני למנגנוני תיקון פוסט-רפליקציה (MMR, שיידון בהמשך הקורס).

קוהיזין מתיישב מיד לאחר הרפליקציה על הכרומטידות האחיות ומחזיק אותן יחד עד לאנאפאזה של המיטוזה, שם ספראז מסיר אותו.

טבלת השוואה: פרוקריוטים מול אאוקריוטים

מחלות Trinucleotide Repeat

מחלות אלה (Trinucleotide Repeat Diseases, TRDs) נגרמות מהתארכות בלתי-נורמלית של רצפים חוזרים בני שלושה נוקלאוטידים בגנום. בכל מחזור רפליקציה, מספר החזרות עשוי לגדול, מה שמוביל לפתולוגיה.

Fragile X

מחלה מהשכיחות ביותר לפיגור שכלי, מופיעה בסל הבדיקות של משרד הבריאות בישראל. המאפיינים:

• רצף חוזר: CGG
• מיקום החזרה: בפרומוטור של הגן FMR1 (הגן המעורב במחלה)
• מצב תקין: בערך עד 50–70 חזרות
• מצב נשאות (premutation): מאות שאינן גורמות למחלה אך מתארכות בכל דור
• מצב פתולוגי: מעל 200 חזרות CGG ← היפרמתילציה של הפרומוטור (CpG islands) ← השתקת הגן ← לא מתקבל חלבון FMR1 ← הגן חיוני להתפתחות מוחית עוברית ← פיגור שכלי קשה

מנגנון המתילציה: CG/CpG הם האות לאנזימי המתילציה. כאשר יש יותר מ־200 חזרות, ריכוז ה־CpG גדול מאוד והאזור הופך להיות hypermethylated ומושתק.

הנטינגטון (Huntington’s Disease)

• רצף חוזר: CAG (מקודד לגלוטמין)
• מיקום: בתוך האזור המקודד של הגן
• עודף חזרות CAG יוצר שרשרת פוליגלוטמין ארוכה בחלבון הנטינגטין ← קיפול לקוי, אגרגציה של חלבונים ← חוסר בחלבון פונקציונלי ← מחלה ניוונית עצבית ושרירית עם הופעה מאוחרת.

מיוטונית דיסטרופי (Myotonic Dystrophy)

• רצף חוזר: CTG
• מנגנון: החזרות משפיעות על alternative splicing של ה־RNA ← פגיעה בתפקוד שרירי.

מנגנון ההתארכות - Slippage

כאשר ה־DNA נפתח לחד־גדיל, רצפים חוזרים יכולים להתקפל על עצמם וליצור מבנה stem-loop. בנקודה זו:

• אם ה־DNA פולימרז מדלג על הלולאה ← התקצרות של הרצף.
• אם ה־DNA פולימרז מחזר אחורה ומסנתז שוב חלק מהרצף ← התארכות של הרצף (expansion).

תהליך ה-slippage הזה, בעיקר בנשאיות (premutation carriers), גורם להתארכות הדרגתית מדור לדור עד למעבר לסף הפתולוגי.

סיכום מזלג הרפליקציה - תהליך שלם

1. ORC נקשר לאתר ראשית הכפלה (AT-rich, nucleosome-free, negative supercoiling).
2. ה־ORC גייס MCM (הליקאז), שנשאר לא־פעיל עד שלב S.
3. בשלב S, קסקדת פוספורילציות (CDC45, SLD3) מפעילה את ה־MCM, שמתנתק מה־ORC ופותח את הדו־גדיל.
4. טופואיזומרז מסיר positive supercoiling שנוצר מלפני ההליקאז.
5. RPA מצפה את ה־DNA החד־גדילי ומונע היסגרות.
6. DNA פולימרז אלפא (פרימאז) מסנתז פריימרים (~10 RNA + ~10–20 DNA, פידליטי נמוך).
7. ה־PCNA (sliding clamp) נועל את ה־DNA פולימרז הרפליקטיבי על ה־DNA.
8. Pol ε מסנתז את ה־leading strand באופן רציף (5’←3’).
9. Pol δ מסנתז את ה־lagging strand במקטעי אוקזקי (100–200 נ”ק באדם), כל אחד לאחר פריימר של Pol α.
10. FEN1 מסלקת flaps של פריימרים, Pol δ ממלאת, DNA ליגאז סוגר nicks.
11. מיד לאחר מעבר המזלג - FACT וקומפלקסים נוספים אורזים בחזרה לכרומטין; קוהיזין מחבר את הכרומטידות האחיות.