שיעור 12 MSI, שברי DNA ומעכבי PARP

חזרה על השיעור הקודם

נחזור תחילה על Bulky lesions, ‏NER, ‏TLS ו־MMR:

• בחולי XP-C ו־XP-E, הרגישות ל־UV נמוכה יותר יחסית לקבוצות XP אחרות, כי ה־TC-NER ‏(Transcription coupled) עדיין תקין אצלם. הפגיעה היא בעיקר בזיהוי ה־GG-NER ‏(Global Genome).

• הגן שנפגע ב־XP-V הוא Polymerase η (לא אחד מגני XP הקלאסיים של NER). לכן הבעיה היא ב־TLS מעל נזקי UV.

• חולי XP נוטים לפתח גם סרטנים פנימיים ולא רק סרטן עור, משום ש־NER מתקן גם bulky lesions ממקורות כימיים פנימיים, ולא רק T-dimers מקרינת UV.

• ביטוי מוגבר של פקטורי שעתוק ממשפחת ETS צפוי לגרום ליותר T-dimers באתרים שאליהם הם נקשרים, כי הקישור שלהם מקרב את התימינים זה לזה.

• עמידות ל־cisplatin יכולה לנבוע מ־TLS מוגבר: התא מצליח לשכפל מעל הנזק במקום לעצור ולעבור אפופטוזיס.

• באאוקריוטים, strand discrimination ב־MMR נעזר בניקים או ב־DNA חד־גדילי בגדיל המסונתז, ולא במתילציה כמו ב־E. coli.

• PCNA משתתף גם ב־MMR וגם ב־TLS: ב־MMR הוא עוזר לזהות את הגדיל החדש, וב־TLS הוא עובר mono-ubiquitination ומגייס פולימראזות TLS.

• עלייה בביטוי RNase-H אינה צפויה לעודד קריסה של מזלג השכפול, כי RNase-H מפרק R-loops בכך יכול להפחית מכשולים לשכפול. למדנו על האנזים הזה בשיעור 9.

מכאן חזרנו ל־MMR, והפעם התמקדנו בפתולוגיות שקשורות לחסר ב־MMR.

MMR Deficiency ו־Microsatellite Instability

חזרה על MMR

MMR מזהה טעויות שנוצרות במהלך שכפול DNA. החלבון המרכזי בשלב הזיהוי הוא MutS בחיידקים, או MSH באאוקריוטים. הוא מזהה עיוות קטן במבנה ההליקס שנוצר בגלל mismatch, נסגר סביבו, ומגייס את שאר מנגנון התיקון.

האתגר המרכזי הוא strand discrimination: אחרי שנוצר mismatch, צריך לדעת איזה גדיל הוא הישן והתקין, ואיזה גדיל הוא החדש שבו כנראה נפלה הטעות.

שני פתרונות:

• ב־E. coli משתמשים במתילציה של אדנין. הגדיל הישן כבר ממותל, והגדיל החדש עדיין לא.
• באאוקריוטים משתמשים בניקים ובאזורים חד־גדיליים בגדיל המסונתז, בעזרת PCNA. ב־lagging strand יש מקטעי אוקזקי, וב־leading strand יש קצה חדש באזור מזלג השכפול.

בסוף התהליך המקטע שמכיל את הטעות מוסר, ואז DNA polymerase δ מסנתז מחדש ו־ligase סוגר את הקצוות.

Microsatellites

Microsatellites הם אזורי DNA חוזרני קצרים, שבהם אותו רצף קצר חוזר מספר פעמים.

הם נמצאים באזורים מסוימים בגנום, לרוב באזורים לא מקודדים. מה שהופך אותם לשימושיים הוא שמספר החזרות משתנה בין אנשים שונים. לכן פרופיל של כמה microsatellites יכול לשמש כטביעת אצבע גנטית. אם בודקים מספר אתרי microsatellite שונים ומשווים את אורכי החזרות, אפשר לזהות התאמה בין דגימות DNA.

Replication Slippage

Microsatellites רגישים במיוחד לתופעה שנקראת replication slippage. כל חזרה ברצף יכולה להתאים לכל חזרה אחרת, לכן בזמן שכפול DNA, הגדיל המסונתז וה־template יכולים ״להחליק״ זה ביחס לזה, ואז נוצרת לולאה.

הלולאה יכולה להיווצר בשני מקומות:

• אם היא נוצרת בגדיל המסונתז - מספר החזרות יכול לגדול.
• אם היא נוצרת בגדיל האב / template - מספר החזרות יכול להתקצר.

MMR מזהה את המבנה הלא תקין, חותך ומתקן אותו. לכן MMR שומר על יציבות מספר החזרות.

במצבי MMR deficiency, ה־slippage לא מתוקן בצורה טובה. התוצאה היא שינוי במספר החזרות במיקרוסטלייטים. קוראים לזה Microsatellite Instability ‏(MSI), או בסרטנים עם רמה גבוהה של התופעה: MSI-high.

MSI בסרטן ובטיפול אימונותרפי

MSI-high נפוץ במיוחד במספר סוגי סרטן, כמו:

• colorectal cancer
• endometrial cancer
• gastric cancer

כשיש חסר ב־MMR, הטעויות שנוצרות בזמן שכפול אינן מתוקנות. לכן לסרטנים מסוג MSI-high יש בדרך כלל עומס מוטציות גבוה.

החיסרון: עומס מוטציות גבוה יכול לתרום לטרנספורמציה סרטנית, למשל על ידי פגיעה ב־tumor suppressor genes או יצירת שינויים שמקדמים חלוקה והישרדות.

אבל יש גם צד טיפולי חשוב: עומס מוטציות גבוה יכול ליצור הרבה חלבונים חדשים או מקטעי חלבון חדשים שהתא לא הציג קודם. אלו נקראים: Neoantigens.

Neoantigens

Neoantigens הם אנטיגנים חדשים שנוצרים בעקבות מוטציות. כשיש בתא סרטני הרבה מוטציות, נוצרים חלבונים או פפטידים שמערכת החיסון יכולה לזהות כלא־עצמיים (Non-self). לכן, מבחינת מערכת החיסון, סרטן MSI-high יכול להיות יותר ״בולט״.

זה מסביר למה סרטנים MSI-high יכולים להגיב טוב לטיפול אימונותרפי.

הסרטן מכבה את מערכת החיסון

אחד המנגנונים שבאמצעותם תאים סרטניים מתחמקים ממערכת החיסון, הוא דיכוי תגובת מערכת החיסון. מנגנון שקשור ל־PD-1, שהוא רגולטור שלילי של מערכת החיסון.

טיפול אימונותרפי, למשל בעזרת immune checkpoint inhibitors כמו anti-PD-1, מנסה לשחרר את העיכוב ולאפשר למערכת החיסון לפעול נגד התא הסרטני.

לכן, בחולה עם סרטן MSI-high, יש היגיון טיפולי להשתמש ב־immune checkpoint inhibitors (אימונותרפיה): מצד אחד יש הרבה neoantigens, ומצד שני הטיפול מסיר את הדיכוי שמונע ממערכת החיסון להגיב אליהם.

MSI Test ו־Lynch syndrome

בדיקה עצמית: מה זה MSI?

MSI Test

כדי לבדוק אם גידול הוא MSI-high, משווים בין DNA מרקמה בריאה לבין DNA מהרקמה הסרטנית של אותו אדם.

הרעיון:

1. בוחרים מספר אתרי microsatellite
2. מגבירים אותם ב־PCR בעזרת פריימרים ספציפיים
3. בודקים את אורכי המקטעים
4. משווים בין הרקמה הבריאה לרקמה הסרטנית

ברקמה הבריאה, פרופיל המיקרוסטלייטים מייצג את המצב המקורי של האדם. אם ברקמה הסרטנית מופיעים פיקים חדשים או שונות באורכים, זה סימן ל־microsatellite instability.

ב־electropherogram אפשר לראות הבדלים באורכי המקטעים. לא בהכרח חשוב איזה שינוי ספציפי קרה בכל microsatellite; מה שחשוב הוא שיש שונות רחבה שמצביעה על חוסר יציבות ועל MMR deficiency.

המידע מאפשר לבחור טיפול מתאים, במיוחד בהקשר של אימונותרפיה.

Lynch Syndrome

Lynch syndrome הוא סינדרום (תסמונת) תורשתי, שבו יש נטייה לפתח סרטנים מסוימים, במיוחד colorectal cancer, בגלל פגיעה בגנים של MMR.

הגנים בהקשר זה הם בעיקר:

• MLH
• MSH

כשאדם נושא מוטציה בגנים של MMR, יש לו נטייה מוגברת לפתח גידולים עם MSI-high.

בנוסף ל־Lynch syndrome, ה־MSI יכול להופיע גם באופן נרכש במהלך החיים. לדוגמה:

• Epigenetic misregulation, למשל hypermethylation והשתקה של גן MMR כמו MLH1.
• Over-expression של microRNA, למשל miR-155, שיכול להוריד ביטוי של גנים הקשורים ל־MMR.

הנתונים לגבי colorectal cancer:

• בערך 15% ממקרי colorectal cancer הם MSI-high
• מתוך מקרי MSI-high, בערך 20% קשורים ל־Lynch syndrome
• בערך 80% הם מקרים ספורדיים

Single-strand breaks ‏(SSBs)

לאחר סיום החלק על TLS ו־MMR, נעבור כעת לנושא חדש: DNA breaks.

עד עתה דיברנו על:

• נזקים ברמת הבסיס
• bulky lesions
• טעויות זיווג ותיקון MMR

כעת נעבור לשברים ב־DNA:

• Single-strand breaks - SSBs
• Double-strand breaks - DSBs

מהו SSB?

SSB הוא נזק שבו שרשרת הסוכר-פוספט נחתכת באחד משני גדילי ה־DNA.

זהו נזק נפוץ מאוד - סדר גודל של 10,000 עד 100,000 שברים חד־גדיליים לתא ביום.

הוא נפוץ לא רק בגלל גורמים חיצוניים, אלא גם כי הוא מופיע כתוצר ביניים של תהליכים תקינים ותהליכי תיקון אחרים.

מקורות ל־SSBs

מקורות עקיפים:

• Base Excision Repair - למשל אחרי פעילות APE1, נוצר ניק כחלק מהתהליך.
• Nucleotide Excision Repair - חלבונים כמו XPF ו־XPG חותכים את ה־DNA סביב הנזק.
• Mismatch Repair - נדרש חיתוך של הגדיל החדש כדי להסיר את האזור השגוי.
• Okazaki fragments - ב־lagging strand יש ניקים עד שהמקטעים מחוברים.
• Topoisomerase I - יוצר שבר חד־גדילי זמני כחלק משחרור מתח טופולוגי.

מקורות ישירים:

• Ionizing radiation
• Reactive Oxygen Species ‏(ROS)

כמעט כל תהליך שמוביל ל־BER, ‏NER או MMR יכול ליצור SSB כתוצר ביניים. לכן SSBs קיימים בכל מקום, ונדרשת מערכת תיקון יעילה מאוד.

תיקון SSB ו־PARP1

השחקן המרכזי בתיקון שברים חד־גדיליים הוא PARP1.

זיהוי, PARylation וגיוס XRCC1

תחילה, PARP1 מזהה SSB.

לאחר הזיהוי, עושה על עצמו PARylation (מוסיף על עצמו שרשראות סוכרים/פולימרים של ADP-ribose) - זו מודיפיקציה לאחר תרגום, והיא משמשת כסיגנל לגיוס חלבונים נוספים.

לאחר ה־PARylation מגויס החלבון XRCC1. ‏XRCC1 הוא scaffold protein - חלבון פיגום שמגייס ומארגן סביבו חלבונים אחרים הדרושים לתיקון.

בשלב הבא, XRCC1 מגייס חלבונים שמנקים את קצוות השבר, למשל:

• APE1
• PNKP

המטרה היא להכין קצוות מתאימים לתיקון: צד אחד עם הידרוקסיל וצד שני עם פוספט, כדי שפולימראז וליגאז יוכלו לפעול.

לאחר ניקוי הקצוות:

• פולימראז משלים נוקלאוטידים חסרים, אם יש בכך צורך
• ליגאז סוגר את הניק

הקשר בין SSB repair לבין BER

SSB יכול להיווצר כחלק תקין מ־BER. במקרה כזה אין צורך להפעיל מחדש את כל מנגנון PARP1, כי הנזק כבר זוהה ומנגנון התיקון כבר פועל.

לכן, ב־BER, יש מעין העברת שרביט: פקטורי BER מגייסים ישירות את XRCC1, וכך מדלגים על הצורך בגיוס PARP1.

בדיקה עצמית: מה זה PARP1?

זה הופך את התהליך ליעיל יותר ומונע בזבוז אנרגיה. אם התהליך נכשל, PARP1 עדיין יכול לזהות את ה־SSB ולהפעיל תיקון מלא.

Topoisomerase I Cleavage Complex

Topoisomerase I משחרר מתח טופולוגי על ידי יצירת שבר חד־גדילי זמני. בדרך כלל הוא מחזיק את הקצוות ומחבר אותם מחדש בעצמו, אבל לפעמים נוצר Top1 cleavage complex שלא נפתר. במצב כזה יש חלבון שקשור קוולנטית ל־DNA, וזה יוצר בעיה מורכבת יותר מ־SSB רגיל.

PARP1 פועל גם כאן: הוא מגייס את TDP1, חלבון שיודע להסיר protein-DNA adducts כמו ה־Top1 שתקוע על ה־DNA. לאחר הסרת החלבון, ניתן להמשיך לתיקון השבר החד־גדילי.

מעכבי PARP בטיפול אנטי-סרטני

מעכבי PARP הם משפחה חשובה של תרופות אנטי-סרטניות. הרעיון הוא לעכב את PARP1, וכך לפגוע בתיקון של SSB.

יש שתי דרכי פעולה מרכזיות:

1. עיכוב קטליטי של PARP1 - אם PARP1 מעוכב, SSBs לא מתוקנים בצורה יעילה. חלק מהשברים החד־גדיליים עלולים להפוך בזמן שכפול ל־double-strand breaks. כשמצטברים הרבה DSBs, התא עלול לעצור שכפול ולעבור אפופטוזיס.

2. PARP trapping - ה־PARP נשאר ״תקוע״ על ה־DNA. כשמזלג השכפול מגיע לאזור, ה־PARP התקוע מפריע לפולימראז להתקדם, ויכול לגרום לקריסה של מזלג השכפול ולנזקי DNA חמורים יותר.

Synthetic Lethality

מעכבי PARP יעילים במיוחד בהקשרים של synthetic lethality. הרעיון: פגיעה אחת לבדה לא בהכרח הורגת את התא, אבל שתי פגיעות יחד כן.

לדוגמה:

• מצד אחד מעכבים PARP, ויוצרים עומס SSBs שיכולים להפוך ל־DSBs.
• מצד שני, אם לתא יש BRCA deficiency (נרחיב עליהם בהמשך), יש לו בעיה בתיקון של אותם DSBs.

השילוב בין יצירת שברים לבין חוסר יכולת לתקן אותם מוביל למוות תאי. לכן בחולות עם רקע של BRCA deficiency, ‏PARP inhibitors יכולים להיות יעילים במיוחד. המנגנון יורחב בשיעור על תיקון double-strand breaks ו־homologous recombination.

Double-strand breaks ‏(DSBs)

DSB הוא קריעה של שני גדילי ה־DNA, כלומר שבירה של הכרומוזום לשני חלקים.

זהו אחד הנזקים החמורים ביותר שיכולים לקרות ל־DNA, משום שהוא יכול להוביל ל:

• מחיקות
• קיצור של כרומוזום
• טרנסלוקציות
• יצירת גן חדש או אונקוגן חדש
• פגיעה ב־tumor suppressor genes

לדוגמה, Philadelphia chromosome, שבו נוצר fusion בין גנים שונים, והתוצר הוא חלבון עם פעילות שמעודדת תכונות סרטניות.

מקורות ל־DSBs

• Replication fork collapse - קריסה של מזלג השכפול.
• SSB שלא תוקן לפני רפליקציה - כשמזלג השכפול פוגש שבר חד־גדילי, זה יכול להפוך ל־DSB.
• ROS - יכולים ליצור שברים, כולל שברים דו־גדיליים.
• Topoisomerase II - יוצר שבר דו־גדילי זמני כדי לשחרר מתח טופולוגי.
• Programmed recombination - תהליכים פיזיולוגיים שבהם התא יוצר שברים בכוונה, למשל V(D)J recombination במערכת החיסון.
• Meiotic recombination - לפני מיוזה יש שבירה יזומה של DNA, למשל על ידי SPO11, כדי לאפשר שחלוף בין כרומוזומים הומולוגיים.
• Ionizing radiation
• תרופות כימותרפיות, למשל Toposide, שפוגע בפעולת Topoisomerase II ויכול לגרום ל־DSBs.

גם טיפולים כאלה יכולים ליצור סיכון לסרטן שניוני, משום שהם עצמם גורמים לנזקי DNA. לגבי Toposide סדר גודל של כ־3% סיכון לסרטן שניוני כתוצאה מהטיפול.

מנגנוני תיקון עיקריים ל־DSBs

יש שני מנגנוני תיקון עיקריים:

NHEJ אינו משתמש בתבנית, ולכן הוא פחות מדויק. הוא פועל לאורך מחזור התא, אבל הבחירה בו משמעותית במיוחד כשאין כרומטידה אחות זמינה.

HR ‏(Homologous Recombination) מבוסס על כרומטידה אחות כתבנית, ולכן הוא מדויק יותר, אבל הוא אפשרי בעיקר לאחר שכפול DNA, כלומר ב־S-phase או G2.

תיקון DSB כתגובה מערכתית

כשיש DSB, התא לא רק ״מדביק״ את הקצוות. הוא צריך לתאם כמה מערכות:

• תיקון DNA
• עצירת מחזור התא
• בחירת מנגנון תיקון לפי שלב מחזור התא
• פתיחת כרומטין סביב האזור
• הגברת הסיגנל כדי שחלבונים רבים יגויסו לאתר הנזק

החלבון שמהווה מתאם מרכזי הוא ATM; מעין ״רמטכ״ל״ של התגובה ל־DSB, כי הוא מתאם בין תיקון DNA, מחזור התא וכרומטין.

Non-Homologous End Joining ‏(NHEJ)

NHEJ חוזר לאותה תבנית כללית של מנגנוני תיקון:

1. זיהוי
2. עיבוד
3. תיקון

זיהוי והגנה על הקצוות

החלבון הראשון שמזהה את הקצוות הוא Ku. ‏Ku מזהה קצוות של DNA, נקשר אליהם ומגן עליהם. קצוות DNA הם אזורים רגישים במיוחד, ולכן התא צריך לייצב אותם מהר.

לאחר מכן Ku מגייס את DNA-PK, שפועל כמעין גשר בין שני הקצוות ומחזיק אותם קרובים זה לזה.

עיבוד הקצוות

לפני שאפשר לחבר את הקצוות, צריך לנקות אותם ולהכין אותם לליגציה.

דוגמאות לפקטורים רלוונטיים (לכאורה לא נדרש לזכור את כולם):

• Artemis (על שם האלה היוונית)
• פולימראזות שונות
• PNKP

המטרה היא להגיע לקצוות שניתנים לחיבור.

בדיקה עצמית: מה צריך להיות בקצה DNA כדי שניתן יהיה לחבר אותו?

חיבור הקצוות

בשלב התיקון:

• XRCC4 פועל כ־scaffold protein, בדומה ל־XRCC1 בתיקון SSBs
• Ligase IV מחבר את הקצוות

הדגש הוא ש־XRCC1 קשור ל־SSB repair, ואילו XRCC4 קשור ל־DSB repair דרך NHEJ.

NHEJ Deficiency

כשיש חסר ב־NHEJ, למשל בפקטורים כמו ligase, ‏Artemis או DNA-PK, עלולות להופיע כמה בעיות:

• רגישות לקרינה מייננת - כי קרינה מייננת יוצרת DSBs (קרינת UV לא יוצרת DSBs, אלא בעיקר T-dimers).
• מוות תאי מוגבר - הצטברות DSBs יכולה להוביל לאפופטוזיס.
• סיכון מוגבר לסרטן - בגלל תיקון לקוי ושינויים גנומיים.
• SCID ‏- Severe Combined Immune Deficiency.

הקשר ל־SCID הוא דרך מערכת החיסון. כדי ליצור נוגדנים וקולטנים לתאי T, יש צורך ב־V(D)J recombination, תהליך שכולל יצירת DSBs וחיבור מחדש של DNA. אם אין תיקון תקין של השברים האלה, לא ניתן ליצור רפרטואר תקין של רצפטורים חיסוניים.

הסיכון הגנומי ב־NHEJ

NHEJ חיוני, אבל הוא גם יכול ליצור בעיות; מכיוון שהוא מחבר קצוות DNA בלי להשתמש בתבנית, הוא עלול לחבר קצוות לא נכונים. זה נקרא mis-joining.

תוצאה אפשרית:

• מחיקות
• טרנסלוקציות
• חיבור בין קצוות מכרומוזומים שונים
• איבוד או הוספה של כמה נוקלאוטידים באזור החיבור

זה יכול ליצור אונקוגן חדש או לפגוע ב־tumor suppressor gene.

יש פרדוקס מסוים: גם חסר ב־NHEJ וגם פעילות לא מדויקת של NHEJ יכולים לתרום לסרטן.

Alternative NHEJ

אם NHEJ הקלאסי לא עובד, עדיין צריך מנגנון גיבוי כלשהו. למשל, מנגנון בשם Alternative NHEJ.

זהו מנגנון גיבוי שמנסה להשתמש בהומולוגיה קצרה בקצוות כדי לחבר אותם. הוא יכול להציל את התא במצב שבו אין פתרון אחר, אבל הוא בעייתי יותר ומועד למחיקות, משום שבדרך כלל צריך להסיר כמה נוקלאוטידים כדי למצוא בין הקצוות התאמה.

גם כאן חוזר עקרון הפשרה: התא מעדיף תיקון לא מושלם על פני השארת שבר בלתי מתוקן.

סיכום

בדיקה עצמית: מה מתקן MMR, ומה הקשר בינו לבין MSI?

בסרטנים מסוג MSI-high יש עומס מוטציות גבוה. זה יכול לקדם סרטן, אבל גם ליצור neoantigens שהופכים את הגידול לרגיש יותר לטיפול אימונותרפי, במיוחד immune checkpoint inhibitors כמו anti-PD-1.

לאחר מכן עברנו לשברי DNA.

בדיקה עצמית: מהו SSB, ומה גורם לו?

בדיקה עצמית: מהו PARP1, ומה תפקידו ב־SSBs?

מעכבי PARP מנצלים את התלות הזאת בתיקון SSBs. הם גורמים להצטברות שברים, יכולים לתקוע PARP על ה־DNA, ובמיוחד יעילים ברקע של BRCA deficiency בגלל synthetic lethality.

בסוף השיעור עברנו ל־double-strand breaks, שהם הנזק החמור ביותר שנדון עד עכשיו. DSBs יכולים לגרום למחיקות, טרנסלוקציות ואונקוגנים חדשים. התיקון שלהם נעשה בעיקר על ידי NHEJ או HR. ‏NHEJ מהיר וזמין גם ללא כרומטידה אחות, אבל הוא פחות מדויק; HR מדויק יותר, אך דורש כרומטידה אחות ולכן מתאים בעיקר ל־S/G2.

NHEJ חיוני גם למערכת החיסון, כי V(D)J recombination דורש יצירת וחיבור DSBs. לכן חסר ב־NHEJ יכול לגרום גם לרגישות לקרינה, סיכון לסרטן וגם ל־SCID.