תוכן העניינים:

  1. פתיחה: על מה השיעור
  2. Cdx2: מה לומדים מניסוי Loss of Function
  3. תאי אפיתל ו־Tight Junctions
  4. יצירת ה־Blastocoel
  5. מה קורה ב־Cdx2 KO?
  6. ניסוי תרבית: Outgrowth של Trophectoderm
  7. Cdx2 מדכא Oct4 ו־Nanog ב־Trophectoderm
  8. Compaction
  9. siRNA וניסוי E-cadherin
  10. Polarization
  11. First cell fate decision: תאים חיצוניים מול תאים פנימיים
  12. מישור החלוקה: חלוקה סימטרית וא-סימטרית
  13. Cdx2, פולריות ולוקליזציה של mRNA
  14. Hippo signaling: איך תא יודע שהוא בפנים?
  15. Amot, NF2 והקשר ל־Adherens Junctions
  16. חיבור המודל: Cdx2, פולריות ו־Hippo
  17. Zygotic Genome Activation וגלי כניסה ל־ICM
  18. Positive feedback loops ברשת פקטורי השעתוק
  19. Second cell fate decision ו־FGF signaling
  20. רצף האירועים המרכזי
  21. משפטי מפתח

פתיחה: על מה השיעור

בשיעור הקודם הוצגו כמה פקטורי שעתוק חשובים בהתפתחות המוקדמת: Oct4, Nanog, Cdx2, Gata4 ו־Gata6. בשיעור הזה המוקד עובר ל־Cdx2 ולשאלה איך הוא משתתף ב־First cell fate decision, כלומר ביצירת ההבחנה בין תאים חיצוניים שיהפכו ל־Trophectoderm לבין תאים פנימיים שיהפכו ל־ICM.

בהמשך השיעור נכנס גם ה־Second cell fate decision, שבו תאי ה־ICM נפרדים לכיוון Epiblast או Primitive endoderm.

Cdx2: מה לומדים מניסוי Loss of Function

כדי להבין את התפקיד של Cdx2, מסתכלים על עובר תקין לעומת עובר מוטנט שבו Cdx2 חסר.

Cdx2 loss of function

בעובר תקין, לאורך הזמן מתקבל בלסטוציסט עם Trophectoderm, Blastocoel ו־ICM.

במוטנט ל־Cdx2 מתחיל להיווצר Blastocoel, ולכן נראה שהעובר מתחיל להיכנס למסלול של יצירת בלסטוציסט. אבל תוך זמן קצר ה־Blastocoel נעלם, מתרחשת קריסה ומתקבל גוש תאים.

המסקנה הראשונה: העובר מסוגל להתחיל תהליך של יצירת Blastocoel ללא Cdx2, אבל לא לשמר אותו.

כדי להבין למה זה קורה, צריך להבין קודם איך נוצר ה־Blastocoel ומהו מחסום אפיתליאלי.

תאי אפיתל ו־Tight Junctions

Tight Junctions & Adherens Junctions

תאי אפיתל הם שכבת תאים שמפרידה בין שני חללים. לדוגמה, תאי אפיתל יכולים להפריד בין חלל מערכת העיכול לבין הגוף, או בין לומן של כלי דם לבין הרקמה שסביבו.

לתאי אפיתל יש בדרך כלל שני צדדים:

צד בתא משמעות
Basal / Basolateral domain הצד שפונה לממברנה בזלית או לתאים שכנים
Apical domain הצד שפונה לחלל או לסביבה החיצונית
Tight Junction

בקצה האפיקלי של תאי אפיתל יכולים להופיע Tight junctions. אלה קומפלקסים של חלבונים שמצמידים את הממברנות של שני תאים שכנים, כך שהמעבר בין התאים נחסם.

ההבדל בין שני סוגי החיבורים:

מבנה תפקיד עיקרי בשיעור
Adherens junctions הצמדה מכנית בין תאים, בין היתר דרך E-cadherin
Tight junctions יצירת מחסום שמונע מעבר בין התאים

הנקודה החשובה היא ש־Tight junctions לא מאפשרים למים, יונים או חומרים אחרים לעבור בין התאים. אם משהו עובר מצד אחד לצד השני, הוא צריך לעבור דרך התא עצמו ולא בין התאים.

יצירת ה־Blastocoel

תעלות Na+/K+-ATPase

בשלב המורולה יש תאים פנימיים ותאים חיצוניים. כל התאים מחוברים זה לזה דרך Adherens junctions, אבל רק התאים החיצוניים מתנהגים כתאים אפיתליאליים ויוצרים Tight junctions בצד האפיקלי שלהם.

המשאבה בתמונה למעלה מוציאה יוני נתרן ומכניסה יוני אשלגן תוך שימוש ב־ATP. החשיבות כאן אינה בעיקר המטען החשמלי אלא שינוי ריכוז היונים: כאשר ריכוז היונים עולה באזור שבין התאים, נוצר לחץ אוסמוטי שמושך מים.

הסדר הוא כזה:

  1. המשאבות יוצרות ריכוז יונים גבוה באזור הבזולטרלי, בין התאים.
  2. מים נעים דרך התאים בעקבות הלחץ האוסמוטי.
  3. נוצרים חללים קטנים של נוזל בין התאים.
  4. החללים הקטנים נעים, מתאחדים ויוצרים חללים גדולים יותר.
  5. בסופו של דבר נוצר חלל מרכזי אחד - Blastocoel.
Formation of the blastocoel, At morula stage, cortical F-actin assembles a ring at the apical pole, which expands laterally to the cell-cell contacts, where it couples to and stabilises the intercellular junctions. This triggers tension-dependent “zippering” of the junctions, which seal the embryo, establishing the permeability barrier. During compaction, the blastomeres acquire epithelial polarity that allocates apical and basolateral compartments for the assembly of protein complexes involved in the process of lumenogenesis. Osmotic gradients direct the water influx into the embryo, where the pressurised fluid breaks the cell-cell junctions, forming micrometre-size lumens that discharge their fluid into larger lumens. This culminates in the establishment of a single lumen (blastocoel) that breaks the radial symmetry of the early embryo, transforming the compacted morula into a blastocyst. 

ה־Tight junctions חשובים משום שהם סוגרים את העובר כמערכת. אם לא היה מחסום כזה, הנוזלים היו יכולים לברוח החוצה, והחלל לא היה נשמר.

למה ה־Blastocoel חשוב?

ככל שה־Blastocoel גדל, הוא יוצר לחץ מבפנים כלפי חוץ. בשלב היציאה מה־Zona Pellucida, העובר מפריש פרוטאזות באזור מסוים ויוצר פתח קטן ב־Zona Pellucida. אבל הפתח לבדו אינו מספיק; הלחץ שנוצר על ידי ה־Blastocoel דוחף את העובר החוצה.

ה־Zona Pellucida קשיחה, אבל מים יכולים לעבור דרכה. מה שנשמר הוא המחסום של התאים החיצוניים, דרך ה־Tight junctions.

מה קורה ב־Cdx2 KO?

To evaluate the degree of TE differentiation in Cdx2–/– embryos, we examined the expression of TE-specific markers. One of the characteristics of the TE epithelium is the formation of tight junctions between the TE cells, which facilitate the maintenance of the blastocoel cavity. As Cdx2 homozygous mutants fail to maintain an expanded blastocoel, we examined the expression of the tight junction and adherens junction components in Cdx2 mutant embryos during development. ZO-1α – and ZO-1α + (encoded by Tjp1 ) incorporate into tight junctions early and late during TE formation, respectively (Sheth et al., 1997). E-cadherin localization to the basolateral adherens junctions precedes tight junction formation (reviewed by Fleming et al., 2000; Fleming et al., 2001). Both tight and adherens junctions appeared grossly normal in early blastocysts of both mutant and non-mutant genotype, as assessed by expression of ZO-1α + (four mutants, 15 nonmutants; Fig. 3A,B), ZO-1α - (six mutants, 21 non-mutants; not shown), and E-cadherin (10 mutants, 46 non-mutants; Fig. 3C,D). By contrast, both tight and adherens junctions appeared abnormal in most mutants by the late blastocyst stage. In particular, ZO-1α + appeared patchy or diffuse compared with littermates (7/8 mutants; 12 non-mutants; Fig. 3E,F), while ZO-1α - was diffuse (3/3 mutants, five non-mutants; not shown). E-cadherin expression was still observed in Cdx2–/– blastocysts but appeared to be mislocalized basally in some cells of the TE (6/6 mutants, 13 non-mutants; Fig. 3G,H). These observations suggest that the polarity and integrity of the TE epithelium, while initially normal, is not maintained in the absence of zygotic Cdx2.

בתמונה, העוברים התקינים נמצאים משמאל, והמוטנטים ל־Cdx2 מימין.

בבלסטוציסט מוקדם, גם במוטנט ניתן לראות התחלה של Tight junctions ו־E-cadherin. אבל בבלסטוציסט מאוחר, בעובר התקין יש Blastocoel ברור ומחסום אפיתליאלי יציב, ואילו במוטנט ה־Tight junctions מתפרקים או נעשים לא תקינים.

המשמעות היא שה־Blastocoel מתחיל להיווצר, אבל אינו מוחזק. ברגע שה־Tight junctions לא יציבים, הנוזלים אינם נשמרים, והחלל קורס.

ללא Cdx2, התאים החיצוניים (outer cells) מאבדים את התכונות האפיתליאליות הדרושות לשימור ה־Blastocoel.

ניסוי תרבית: Outgrowth של Trophectoderm

(G-I) Trophoblast outgrowth formation assay. Blastocysts (3.5 dpc) from Cdx2+/– intercrosses were individually cultured in tissue culture plates uncoated or pre-coated with ECM substrate. (G) Outgrowth of a Cdx2+/– embryo. (H,I) Cdx2–/– embryos failed to attach, and formed a rounded mass of cells devoid of a typical blastocoel. Parietal endoderm cells were detected in some Cdx2–/– embryos cultures (K; arrowheads).

בניסוי נוסף לוקחים את העובר ושמים אותו בצלחת בתנאי תרבית.

בעובר תקין, ה־Trophectoderm נפרס על הצלחת, וה־ICM יושב עליו. במוטנט ל־Cdx2, נראה שאין Trophectoderm מתפקד, אלא בעיקר גוש תאים שנראה כמו ICM.

Cdx2 מדכא Oct4 ו־Nanog ב־Trophectoderm

Fig. 4. Reduced expression of trophectoderm markers in Cdx2–/– blastocysts. (A) DIC image of Cdx2+/+ 4.5 dpc blastocyst. Mural TE (mTE), polar TE (pTE), inner cell mass (ICM) and primitive endoderm (PE, arrowheads) indicated. (B) Immunolocalization of Oct4 (red), integrin α7 (blue) in embryo shown in A. Oct4 levels are reduced in the PE (arrows). Integrin α7 is specifically expressed in the trophectoderm (arrowheads in B,C). (C) Composite image of B and YOYO-1 (green, nuclear staining) (B and C are single optical sections). (D) DIC image of Cdx2–/– 4.5 dpc, a littermate of the embryo shown in A, encased in its zona pellucida (arrowhead). (E) Oct4 (red) and integrin α7 (blue) in embryo shown in D. Integrin α7 expression is undetectable, while Oct4 expression is found in almost all cells (compare E with F). (F) YOYO-1 (green) staining in embryo shown in D,E. Many nuclei are fragmented (e.g. arrowhead) (E,F are projected image composed of 10 confocal optical sections). Scale bars: 20 μm.

בצביעה שבתמונה השתמשו ב־Integrin α7 (צבע כחול) כמרקר של Trophectoderm וב־Oct4 (צבע אדום) כמרקר שקשור ל־ICM.

במוטנטים ל־Cdx2, כמעט כל התאים מבטאים Oct4 (צבע אדום בתמונה E), בעוד שמרקר ה־Trophectoderm אינו מופיע כמו בעובר התקין (בתמונה E לא רואים את העיגול הכחול שרואים ב־B). המשמעות היא שאין הפרדה תקינה בין תאי ICM לבין Trophectoderm.

Nanog Immunostaining - salt and paper

גם בבחינת Nanog מתקבלת תמונה דומה: במוטנט, תאים רבים מבטאים Nanog.

המסקנה החשובה: Cdx2 הוא רפרסור של Oct4 ושל Nanog בתאי ה־Trophectoderm.

כדי לבטא ICM מורידים את Cdx2

כלומר, כדי שתא חיצוני יהפוך ל־Trophectoderm, צריך למנוע בו ביטוי של Oct4 ו־Nanog. לעומת זאת, כדי שתא יהיה ICM, צריך להוריד את Cdx2 ולאפשר ל־Oct4 ול־Nanog להתבטא (כמו בתמונה למעלה).

Compaction

עובר לפני ואחרי קומפקשן

במעבר סביב שלב שמונת התאים מתרחשים שני תהליכים חשובים:

  1. Compaction - התאים נצמדים זה לזה ונראים פחות כבלסטומרים נפרדים.
  2. Polarization - התאים מקבלים צד אפיקלי וצד בזולטרלי.

ב־Compaction, הבלסטומרים נצמדים זה לזה בעיקר דרך Adherens junctions, שבהם משתתף E-cadherin.

Figure 3 E-cadherin localization changes during preimplantation development. E-cadherin is distributed throughout the membrane until the late 8-cell stage. Then, it begins to accumulate in cell–cell junctions and is predominantly localized to basolateral regions by the 16-cell stage. Figure 2 E-cadherin is required for cell–cell adhesion and embryo compaction. (A) Microinjection of one cell at the 2-cell stage results in an embryo expressing a control siRNA and a membrane-Cherry marker in half of its cells. The transgenic cells have normal morphology and integrate into the compacting embryo mass. (B) An siRNA targeting E-cadherin reduces cell–cell adhesion in the transgenic half of the embryo. The nontransgenic cells compact normally but the E-cadherin knockdown cells are very spherical and do not integrate into the embryo mass. (C) Treating the embryo with the DECMA-1 E-cadherin function-blocking antibody reduces adhesion and causes all cells to become very spherical. The embryo does not compact. Scale bar 10 μm.

בתחילת הדרך E-cadherin נמצא על פני הממברנה, אבל לאחר Compaction הוא מתרכז באזורי המגע בין התאים. עצם הנוכחות של E-cadherin על הממברנה אינה מספיקה; צריך שייווצרו בין התאים Adherens junctions פעילים.

siRNA וניסוי E-cadherin

Small interference RNA (siRNA)

העיקרון של siRNA: מולקולות RNA דו־גדיליות קצרות יכולות להוביל לפירוק RNA מטרה ספציפי, וכך להוריד ביטוי של גן מסוים. המנגנון הביולוגי כולל חיתוך של dsRNA על ידי Dicer, ובהמשך שימוש בקומפלקס שמזהה את ה־RNA המתאים ומוביל לפירוקו.

Figure 3 E-cadherin localization changes during preimplantation development. E-cadherin is distributed throughout the membrane until the late 8-cell stage. Then, it begins to accumulate in cell–cell junctions and is predominantly localized to basolateral regions by the 16-cell stage.

בניסוי הזה מזריקים לתא אחד בלבד בעובר שנמצא בשלב של שני תאים mRNA שמקודד לסמן אדום. מכיוון שרק תא אחד קיבל את ה־mRNA, רק הצאצאים שלו יהיו מסומנים באדום.

אחרי שהעובר ממשיך להתחלק, בודקים איפה נמצאים התאים האדומים. אם רואים שחצי מהעובר אדום וחצי מהעובר לא אדום, המשמעות היא שהצאצאים של כל אחד משני התאים המקוריים נשארו יחסית יחד. כלומר, התאים לא התערבבו באקראיות מלאה בתוך העובר.

במילים פשוטות: הסמן האדום משמש למעקב אחרי “משפחה” אחת של תאים, ומראה שבשלבים האלה עדיין אפשר לזהות מאיזה תא מוקדם הם הגיעו.

השלב הבא הוא להזריק גם siRNA נגד E-cadherin.

הביקורת חשובה: ייתכן שההזרקה עצמה, הסמן האדום, או עצם הכנסת siRNA גורמים להשפעה. לכן משתמשים גם ב־siRNA אקראי שאינו מכוון נגד גן ספציפי.

התוצאות:

טיפול מה רואים? מסקנה
siRNA ביקורת ביקורת התאים המסומנים משתלבים בעובר שעובר Compaction עצם ההזרקה אינה מספיקה כדי לשבש Compaction
siRNA נגד E-cadherin siRNA נגד E-cadherin התאים שבהם הורד E-cadherin נשארים עגולים ואינם משתלבים היטב E-cadherin דרוש ל־Compaction
נוגדן חוסם נגד E-cadherin נוגדן חוסם E-cadherin כל התאים נפגעים ולא עוברים Compaction תקין הפעילות הישירה של E-cadherin חשובה לתהליך

איך Compaction נוצר בפועל?

Figure 4 E-cadherin-dependent filopodia control embryo compaction. Two cells labeled with a mCherry protein targeted to the cell membrane extend filopodia over their non-labeled neighbors during compaction at the late 8-cell stage. Dashed box shows filopodia at higher magnification.

התאים שולחים שלוחות דמויות זרועות, filopodia, שתופסות את הממברנה של תאים שכנים ומקרבות אותם. התהליך תלוי ב־E-cadherin.

Polarization

Polarization

במקביל ל־Compaction, התאים עוברים Polarization. המשמעות היא שהתא כבר אינו אחיד מכל צדדיו: בצד אחד יש קומפלקס אפיקלי, ובצד אחר יש מגעים עם תאים שכנים.

בצד האפיקלי מופיעים חלבונים כמו Par3, Par6, aPKC ו־Ezrin. הם יוצרים את ה־Apical polarity complex.

Ezrin-GFP

בצביעה של Ezrin ניתן לראות מעין כיפה אפיקלית. הכיפה הזאת מייצגת את האזור שבו מרוכזים חלבוני הפולריות האפיקלית.

Apico-basal cell polarization established at the 8-cell stage in the mouse embryo. The basal domain is defined by cell–cell contacts enriched by adherens junction proteins; the apical domain is enriched by apical polarity proteins, such as Ezrin, Par complex, and Jam-1. The apical domain is surrounded by an actomyosin ring on the outside. Microtubules emanate from the nucleus towards the apical domain.

הכיפה האפיקלית מוקפת בטבעת של אקטין-מיוזין. בנוסף לכך, המיקרוטובולים מכוונים מהגרעין לכיוון האזור האפיקלי.

Movements of actin and apical polarity protein during the apical domain formation. In the first few hours of apical domain formation, the actin becomes polarized to the cell-contact free surface, concurrent with cell compaction. As the actin becomes further centralized to the cell-contact free surface, the apical proteins also polarize to the center of the cell-contact free surface. The accumulation of apical proteins excludes actin to the periphery, to form the actomyosin ring.

בהתחלה אקטין מתרכז באזור החופשי ממגע עם תאים אחרים. בהמשך, חלבוני הפולריות האפיקלית מתרכזים במרכז האזור, והאקטין נדחק לפריפריה ויוצר טבעת.

Compaction ו־Polarization קשורים זה לזה, אבל אינם תלויים לחלוטין זה בזה.

First cell fate decision: תאים חיצוניים מול תאים פנימיים

the connection between cell polarity and localization

לפני ההבחנה בין תאים פנימיים וחיצוניים, בעובר בן שמונה תאים: התאים פולריים. לאחר מכן מתקבל מצב שבו:

אוכלוסייה מצב פולריות גורל עיקרי
תאים חיצוניים פולריים Trophectoderm
תאים פנימיים לא פולריים ICM

השאלה המרכזית היא איך עוברים ממצב סימטרי יחסית למצב שבו יש שתי אוכלוסיות תאים שונות.

שתי היפותזות

היפותזה רעיון מרכזי
Inside-outside hypothesis המיקום קובע את הפולריות: תא שבחוץ יהיה פולרי, תא שבפנים יהיה לא פולרי
Polarity hypothesis הפולריות קובעת את המיקום: תא פולרי יישאר בחוץ, תא לא פולרי ייכנס פנימה

ניסויים שמראים תמיכה בשני הכיוונים:

  • אם מזיזים פיזית תא חיצוני פנימה, הוא יכול לאבד פולריות.
  • אם מזיזים תא פנימי החוצה, הוא יכול להפוך לפולרי.
  • אם מורידים חלבון של הקומפלקס האפיקלי, למשל Par3, התא יכול לעזוב את השכבה החיצונית ולהיכנס פנימה.
  • אם גורמים לתא פנימי לבטא מרכיבי פולריות, הוא יכול להפוך לפולרי ולצאת החוצה.

המסקנה: שליטה בפולריות מאפשרת שליטה במיקום התא, ולכן היא חלק מרכזי ב־First cell fate decision.

מישור החלוקה: חלוקה סימטרית וא-סימטרית

Division plane

מלבד פולריות, יש פרמטר נוסף: מישור החלוקה.

סוג חלוקה מה מתקבל?
חלוקה סימטרית שני תאי בת דומים, שניהם נשארים חיצוניים ופולריים
חלוקה א-סימטרית תא בת אחד מקבל את הקומפלקס האפיקלי ונשאר חיצוני, ותא בת שני אינו מקבל אותו ונכנס פנימה

לכן, כדי לבצע First cell fate decision צריך לשלוט בשני דברים:

  1. פולריזציה
  2. מישור החלוקה

Cdx2, פולריות ולוקליזציה של mRNA

What makes polarization

יש קשר בין רמות Cdx2 לבין מידת הפולריות של התא:

  • יותר Cdx2 ← יותר פולרי
  • פחות Cdx2 ← פחות פולרי

לא צריך לחשוב על פולריות כמצב בינארי של ״פולרי״ או ״לא פולרי״ בלבד, אלא כספקטרום.

Cdx2 mRNA localization vs. transcription

בנוסף לכך, ה־mRNA של Cdx2 לא מפוזר בציטופלזמה באופן אחיד, אלא ממוקם באזור האפיקלי של התא. זו לוקליזציה לא סימטרית של mRNA.

חשוב להפריד בין שני דברים:

רכיב איפה הוא רלוונטי? משמעות
Cdx2 mRNA ממוקם בצד האפיקלי משפיע על מה כל תא בת יקבל בחלוקה
Cdx2 protein פועל בגרעין פקטור שעתוק שמפעיל תוכנית של Trophectoderm

כאשר תא פולרי מתחלק א-סימטרית, תא הבת החיצוני מקבל יותר Cdx2 mRNA, ואילו תא הבת הפנימי מקבל מעט מאוד ממנו. כך נוצר חלון זמן שבו בתא הפנימי רמות Cdx2 נמוכות.

אבל זה לא מספיק: אם התא הפנימי ימשיך לשעתק Cdx2, הרמות יעלו שוב והתא עלול להפוך לפולרי ולחזור החוצה. לכן התא הפנימי צריך גם לכבות את השעתוק של Cdx2.

Hippo signaling: איך תא יודע שהוא בפנים?

השאלה הבאה היא איך תא פנימי יודע שהוא בפנים, ולכן צריך לכבות את השעתוק של Cdx2.

התשובה היא Hippo signaling.

Over the past two decades, components of the Hippo pathway have been elucidated, mainly through genetic screens in Drosophila. The core of the Hippo pathway is commonly depicted as a kinase cascade. Mammalian STE20-like protein kinases (MST1/2) and mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinases (MAP4K1–7) phosphorylate and activate large tumor suppressor kinases (LATS1/2).Subsequently, LATS1/2 phosphorylate and inactivate downstream effectors Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ, also known as WWTR1). Hippo signaling transduction also relies on additional scaffolding proteins such as Salvador homolog 1 (SAV1), WW and C2 domain-containing proteins (WWC1–3), neurofibromin 2 (NF2, also known as Merlin), and MOB kinase activator 1 (MOB1). Recent studies have shown that the core molecular network of the Hippo pathway contains two distinct signaling modules: MST1/2-SAV1-WWC1–3-LATS1/2 (HPO1) and MAP4K1–7-NF2-LATS1/2 (HPO2), in which WWC1-3 and NF2 mediate LATS1/2 activation by upstream Hippo and Hippo-like kinases, respectively. When the Hippo signaling is activated, phosphorylation of YAP triggers its specific binding to cytoplasmic 14-3-3 proteins, leading to its retention in the cytoplasm. Conversely, when the Hippo signaling pathway is inhibited, YAP/TAZ undergoe dephosphorylation and nuclear translocation. YAP/TAZ act as transcriptional co-factors in the nucleus, interact with TEAD1–4, and induce a gene expression program to promote cell proliferation and tissue growth.

כאשר מסלול Hippo פעיל:

  1. LATS פעיל.
  2. LATS מזרחן את YAP/TAZ.
  3. YAP/TAZ נשארים בציטופלזמה.
  4. הם לא נכנסים לגרעין.
  5. אין הפעלה של TEAD.
  6. אין שעתוק של Cdx2.

זה מצב שמתאים לתאים פנימיים.

כאשר מסלול Hippo כבוי:

  1. YAP/TAZ אינם מזורחנים באופן שמחזיק אותם בציטופלזמה.
  2. הם נכנסים לגרעין.
  3. הם פועלים יחד עם TEAD.
  4. TEAD מפעיל שעתוק של Cdx2.

זה מצב שמתאים לתאים חיצוניים.

הנקודה המבלבלת במסלול:

  • כאשר Hippo פעיל, התוצאה היא דווקא חסימה של שעתוק Cdx2.
  • כאשר Hippo כבוי, YAP/TAZ נכנסים לגרעין ומאפשרים שעתוק Cdx2.

Amot, NF2 והקשר ל־Adherens Junctions

Motins are components of the Hippo signaling pathway: Motins directly interact with YAP/TAZ, leading to the sequestration of YAP/TAZ at apical junctions. In addition, Motins facilitate the release of NF2 from its auto-inhibitory state, induce interaction between NF2 and LATS1/2, and activate LATS1/2, leading to YAP/TAZ inhibition. On the contrary, Motins are directly phosphorylated by LATS1/2, which decouples Motins from F-actin. When Hippo signaling is low, dephosphorylated Motins interact with F-actin, and YAP/TAZ translocate into nuclei to induce the expression of target genes.

הוזכרו חלבוני Motin, ובעיקר Amot; Amot יכול להשתתף בהפעלת Hippo דרך NF2 ו־LATS.

Adhesion and polarity determine cell fate in the preimplantation mouse embryo. The apical polarity complex in outer cells sequesters components of the Hippo signaling pathway preventing its activation. Unphosphorylated Yap can enter the nucleus and drive expression of trophectoderm-specific genes. In inner cells, Amot localizes to adherens junctions where it binds to Lats1/2 and the E-cadherin adhesion complex via Nrf2. Lats 1/2 phosphorylates Amot, activating it and this complex phosphorylates Yap. Phosphorylated Yap is excluded from the nucleus and the Hippo pathway is activated, allowing transcription of inner cell mass specific genes.

ההבדל בין תאים פנימיים וחיצוניים:

תא מצב Hippo תוצאה
פנימי Hippo פעיל YAP לא נכנס לגרעין ← אין TEAD פעיל ← אין שעתוק Cdx2
חיצוני Hippo כבוי YAP נכנס לגרעין ← TEAD פעיל ← יש שעתוק Cdx2

בתאים פנימיים יש הרבה מגעים בין תאים ו־Adherens junctions, ולכן יש תנאים להפעלת Hippo. בתאים חיצוניים, הקומפלקס האפיקלי קושר רכיבים כמו Amot ו־LATS והופך אותם לפחות זמינים להפעלת Hippo. לכן בתאים החיצוניים Hippo כבוי, ו־Cdx2 יכול להתבטא.

חיבור המודל: Cdx2, פולריות ו־Hippo

“sensing” the environment (Hippo signaling)

המודל הכללי של First cell fate decision:

  1. בעובר בן שמונה תאים יש פולריות ולוקליזציה אפיקלית של Cdx2 mRNA.
  2. בחלוקה סימטרית, שני תאי הבת נשארים חיצוניים, פולריים, וממשיכים לבטא Cdx2.
  3. בחלוקה א-סימטרית, תא אחד נכנס פנימה ומקבל מעט Cdx2 mRNA.
  4. בתא הפנימי מופעל Hippo.
  5. Hippo מונע כניסת YAP/TAZ לגרעין.
  6. TEAD אינו מפעיל שעתוק של Cdx2.
  7. רמות Cdx2 נשארות נמוכות.
  8. Oct4 ו־Nanog יכולים להתבטא, והתא נשמר בכיוון ICM.

Cdx2 ומישור החלוקה

the division plane

יש גם קשר בין רמות Cdx2 לבין סוג החלוקה:

  • רמות גבוהות יותר של Cdx2 ← סיכוי גבוה יותר לחלוקה סימטרית
  • רמות נמוכות יותר של Cdx2 ← סיכוי גבוה יותר לחלוקה א-סימטרית

חשוב: מדובר בסיכויים, לא בכלל מוחלט.

Early morula

הסכמה בתמונה למעלה, שבה כל התאים בשלב שמונת התאים מבטאים אותה כמות של Cdx2, אינה מדויקת. לפי השיעור, כבר בשלבים האלה יש שונות בין תאים ברמות Cdx2, והשונות יכולה להשפיע על מישור החלוקה ועל יצירת תאים פנימיים.

Zygotic Genome Activation וגלי כניסה ל־ICM

ZGA - Zygotic Genome Activation

בתחילת ההתפתחות, עד שלב שני התאים, הגנום העוברי מושתק, וה־RNA שמניע את השלבים הראשונים מגיע מהביצית. בשלב שני התאים מתרחשת Zygotic Genome Activation (ZGA), כלומר התחלת הפעילות של הגנום העוברי.

נקודה חשובה: תאי ICM אינם נוצרים כולם בבת אחת. יש שני גלים של חלוקות א-סימטריות:

גל מה קורה? גורל מועדף בהמשך
1 תאים נכנסים מוקדם יותר פנימה לרוב Epiblast
2 תאים נכנסים מאוחר יותר פנימה לרוב Primitive endoderm

לאחר מכן מתרחש sorting: תאים שאמורים להיות Primitive endoderm מסתדרים באזור המתאים, ותאים שאמורים להיות Epiblast נשארים באזור אחר.

אם תא מבטא תוכנית שאינה מתאימה למיקום שלו, למשל תא שמבטא Gata4 אך נשאר במקום לא מתאים, העובר יכול להפעיל תהליך של אפופטוזיס. זאת מעין נקודת ביקורת חשובה לפני יצירת האפיבלסט, משום שהאפיבלסט ייתן בהמשך את העובר כולו.

Positive feedback loops ברשת פקטורי השעתוק

Positive feedback loop

בתמונה למעלה מודל של רשת פקטורי שעתוק. המודל לא נדרש ברמת המשוואות, אלא ברמת ההיגיון: שינוי קטן ברמות של פקטור מסוים יכול לעבור הגברה דרך positive feedback loop.

שלוש קבוצות מרכזיות:

קבוצה פקטורים משמעות
Pluripotency maintaining genes Oct4, Nanog, Sox2 שימור כיוון פלוריפוטנטי / Epiblast
Trophectoderm genes Cdx2, Gata3 קידום גורל Trophectoderm
Primitive endoderm genes Gata6, Gata4 קידום גורל Primitive endoderm

בתוך כל קבוצה יש קשרי הגברה חיוביים. בין קבוצות יש קשרי דיכוי. לכן, כאשר קבוצה אחת מתחילה לקבל יתרון, היא יכולה להגביר את עצמה ולדכא את האחרות.

לדוגמה:

  • אם Nanog עולה, הוא יכול לחזק את רשת הפלוריפוטנטיות.
  • אם Cdx2 דומיננטי, הוא מחזק את כיוון ה־Trophectoderm ומדכא את Oct4/Nanog.
  • אם Gata6 עולה, הוא מקדם את כיוון ה־Primitive endoderm ומדכא את הרשת הפלוריפוטנטית.
First Cell Fate Decision

במודל של First cell fate decision, חלוקה א-סימטרית יוצרת חלון זמן שבו תא פנימי מקבל פחות Cdx2. אם בתא הזה יש מעט Nanog, ו־Cdx2 נשאר נמוך בגלל Hippo, רשת הפלוריפוטנטיות יכולה לעבור הגברה ולהשתלט. כך התא נשאר בכיוון ICM.

Second cell fate decision ו־FGF signaling

Transcriptional network + Fgf signaling = Second cell fate decision

בשלב ה־Second cell fate decision, תאי ה־ICM מתפצלים לשני כיוונים:

אוכלוסייה פקטורים מרכזיים גורל
תאים עם Nanog / Oct4 / Sox2 Pluripotency maintaining genes Epiblast
תאים עם Gata6 / Gata4 Primitive endoderm genes Primitive endoderm

כאן נכנס FGF signaling.

  • תא שמבטא Oct4, Nanog ו־Sox2 מבטא את הליגנד FGF4.
  • אותו תא מדכא את הביטוי של הרצפטורים FGFR1/FGFR2, ולכן הוא בעיקר מייצר את הליגנד ולא מגיב לו.
  • תא שהולך לכיוון Gata6 מבטא את הרצפטורים ל־FGF, אבל אינו מבטא את FGF4.
  • כאשר FGF4 נקשר לרצפטור בתא מתאים, מופעל מסלול שמעלה את Gata6, ובהמשך Gata4, ומקדם Primitive endoderm.

הגל הראשון

first wave

בגל הראשון, התאים שנכנסים פנימה מעלים Nanog. בעקבות זאת הם מבטאים יותר FGF4 ומדכאים את הרצפטורים ל־FGF. לכן הם בעיקר מקור לליגנד, ונוטים להישאר בכיוון Epiblast.

הגל השני

second wave

בגל השני, תאים שנכנסים פנימה מגיעים לסביבה שבה כבר יש הרבה FGF4 שהופרש מהתאים של הגל הראשון. גם אם הרצפטורים שלהם בתחילה ברמה נמוכה, כמות הליגנד בסביבה יכולה להפעיל FGF signaling. בעקבות זאת עולה Gata6, שמעלה את רמות הרצפטורים ומדכא את רשת Nanog/Oct4/Sox2. כך התאים האלה נוטים לכיוון Primitive endoderm.

זה ההסבר לכך שתאי Wave 1 נוטים להפוך ל־Epiblast, בעוד שתאי Wave 2 נוטים להפוך ל־Primitive endoderm.

רצף האירועים המרכזי

Zygote
  ↓
2-cell embryo
  ↓
Zygotic Genome Activation
  ↓
4-cell embryo
  ↓
8-cell embryo
  ↓
Compaction + Polarization
  ↓
First cell fate decision
  ├─ Outer cells
  │    ↓
  │  Hippo OFF
  │    ↓
  │  YAP/TAZ + TEAD active
  │    ↓
  │  Cdx2 ON
  │    ↓
  │  Trophectoderm
  │
  └─ Inner cells
       ↓
     Hippo ON
       ↓
     YAP/TAZ kept out of nucleus
       ↓
     Cdx2 OFF
       ↓
     Oct4/Nanog/Sox2 allowed
       ↓
     ICM
       ↓
     Second cell fate decision
       ├─ Nanog / Oct4 / Sox2
       │    ↓
       │  FGF4 ligand
       │    ↓
       │  Epiblast
       │
       └─ FGF response → Gata6 / Gata4
            ↓
          Primitive endoderm

משפטי מפתח

  • Cdx2 חיוני לשימור זהות ה־Trophectoderm וליצירת מחסום אפיתליאלי יציב.
  • ללא Cdx2, ה־Blastocoel יכול להתחיל להיווצר, אבל אינו נשמר.
  • Tight junctions נמצאים בתאים החיצוניים וחשובים לשימור ה־Blastocoel.
  • E-cadherin דרוש ל־Compaction.
  • פולריות ומישור חלוקה הם שני מנגנונים מרכזיים ביצירת inner cells ו־outer cells.
  • Hippo פעיל בתאים פנימיים ומונע שעתוק של Cdx2.
  • Hippo כבוי בתאים חיצוניים ומאפשר שעתוק של Cdx2.
  • Cdx2 מדכא את Oct4 ו־Nanog בתאי ה־Trophectoderm.
  • בתאי ICM, הורדת Cdx2 מאפשרת ל־Oct4/Nanog/Sox2 לשמר פלוריפוטנטיות.
  • ב־Second cell fate decision, FGF4 שמופרש מתאים בכיוון Epiblast משפיע על תאים אחרים ומקדם בהם Gata6/Gata4 ו־Primitive endoderm.
דור פסקל
חזור לסיכום הקודם
חזור לעמוד הקורס