תוכן העניינים:

  1. חזרה על השיעור הקודם - בעיית הקצוות
  2. טלומרים - מבנה ותפקיד
  3. טלומרז (Telomerase)
  4. טופואיזומראז (Topoisomerase)
  5. קשר לסרטן ולרפואה
  6. PCR ויישומים מעבדתיים-קליניים

חזרה על השיעור הקודם - בעיית הקצוות

The end problem of DNA replication The leading and the lagging strands (Okazaki fragments)

בשיעור הקודם דיברנו על מזלג ההכפלה, וראינו כי ה־leading strand מסונתז באופן רציף מן ה־origin ועד לקצה הכרומוזום. לעומתו, ה־lagging strand מסונתז באופן לא רציף, כמקטעי אוקזקי באורך של כ־200 נוקלאוטידים, אורך המשקף בקירוב את גודל היחידה הנוקלאוזומלית.

בעיית הקצוות: כאשר ה־lagging strand מגיע לקצה הכרומוזום, DNA פולימראז α מניח פריימר ומסנתז את מקטע אוקזקי האחרון. לאחר פירוק הפריימר, לא נשאר דבר שניתן להאריך ממנו. ה־DNA פולימראז אינו יכול להשלים את הרצף הזה, משום שהוא אינו מסוגל להתחיל סינתזה של שרשרת חדשה ללא קצה 3’-OH קיים. התוצאה היא שבכל מחזור רפליקציה מתרחשת התקצרות של קצה הכרומוזום.

טלומרים - מבנה ותפקיד

Ageing is associated with telomere shortening

טלומר הוא הקצה של הכרומוזום. אורכו אינו קבוע לחלוטין, אלא נע סביב ערך ממוצע טיפוסי.

אורך הטלומרים נוטה להתייצב סביב אורך קבוע יחסית.

  • כאשר הטלומר ארוך מדי, הוא נוטה להתקצר עד שהוא חוזר לאורך שיווי-המשקל.
  • כאשר הטלומר קצר מדי, הוא נוטה להתארך עד שהוא חוזר לאותו אורך שיווי-המשקל.

לכן, בתאים מתחלקים אורך הטלומר אינו אקראי, אלא נשמר סביב מצב יציב (steady state). מצב זה משקף שיווי-משקל בין שני תהליכים מנוגדים: התקצרות הטלומר במהלך הרפליקציה, והארכתו על־ידי טלומראז (ראו להלן).

גבול הייפליק (Hayflick Limit)

כאשר לוקחים תאים ראשוניים ממקור אנושי ומגדלים אותם במבחנה, הם מבצעים כ־20–50 חלוקות ואז נעצרים ומזדקנים. תופעה זו נקראת גבול הייפליק. הסיבה: קצה הכרומוזום מתקצר בכל חלוקה. כאשר הטלומר מתקצר מספיק, מופעל צ’קפוינט שמונע המשך חלוקה. הטלומר משמש כשעון מולקולרי המודד את גיל התא.

יישום קליני: תאים אימורטליים (שורות תא מעבדתיות, תאים סרטניים) שומרים על יכולת חלוקה בלתי מוגבלת בין השאר בגלל הפעלה של טלומרז (ראו להלן).

אורך טלומרים בסוגי תאים שונים

  • תאים סומטיים נורמליים: אורך הטלומרים מתקצר באופן ליניארי עם כל חלוקה, עד שהם קצרים מדי לתמוך בפעילות ביולוגית ← מחלה / מוות של התא.
  • מחלות הזדקנות מוקדמת: ההתקצרות מתרחשת הרבה יותר מהר מהצפוי - למשל הגעה לסף הקריטי בגיל 40 במקום 80.
  • תאי גזע (Stem cells): אורך הטלומרים יציב - יש מנגנון פעיל (טלומרז) שמשמר אותו.

טלומרז (Telomerase)

Telomerase is an RNA-directed DNA polymerase

טלומרז הוא סוג מיוחד של DNA פולימראז, המכונה גם Reverse Transcriptase - אנזים שמסנתז DNA תוך שימוש ב־RNA כתבנית. (טרנספוזונים ורטרו־וירוסים הם דוגמאות נוספות למולקולות שמשתמשות ברוורס טרנסקריפטאז).

הגילוי: בשנות ה־80, Elizabeth Blackburn (שהחלה כפוסט-דוקטורנטית אצל Joe Gall ב־Yale) זיהתה את הפעילות הזאת. Carol Greider ו־Jack Szostak היו פוסט-דוקטורנטים שלה. שלושתם קיבלו פרס נובל בשנת 2009.

תכונות הטלומרז

תכונה טלומרז
כיוון סינתזה 5’←3’ בלבד
יכולת התחלת שרשרת de novo לא - יודע רק להאריך שרשרת קיימת
צורך בטמפלייט כן - אך הטמפלייט פנימי לאנזים עצמו
סוג הטמפלייט שרשרת RNA קצרה הקבועה בתוך מבנה החלבון

מנגנון הפעולה

Telomerase with bound RNA template

הטלומראז נקשר לקצה ה־DNA החד־גדילי שנותר פתוח לאחר הרפליקציה. הוא משתמש ב־RNA פנימי המשמש כתבנית, ואשר מכיל רצף משלים לרצף הטלומרי, כדי להאריך את קצה ה־3’ של ה־DNA ולהוסיף חזרות של הרצף TTAGGG (באדם).

מנגנון הפעולה:

  1. הטלומראז נקשר לקצה ה־3’ של גדיל ה־DNA.
  2. תבנית ה־RNA הפנימית שלו מנחה את הסינתזה, ובכל מחזור נוספים כ־8 בסיסים.
  3. לאחר מכן הטלומראז זז קדימה על גבי הגדיל.
  4. הוא מבצע שוב סינתזה של אותה יחידת חזרה.
  5. התהליך חוזר על עצמו שוב ושוב.

תוצאה: קצה הכרומוזום מורכב מרצפים חוזרניים שסונתזו לפי תבנית ה־RNA הפנימית של הטלומראז. לכן אזור זה אינו נושא מידע גנטי חיוני שעלול ללכת לאיבוד. ההתקצרות שמתרחשת בכל מחזור רפליקציה מתרחשת בתוך הטלומר עצמו, ולא בתוך הרצף הגנטי החיוני.

לאחר שהטלומראז מאריך את הגדיל, נוצר single-strand overhang — כלומר, קצה שבו גדיל אחד ארוך יותר מן הגדיל המשלים. גדיל מוארך זה יכול לשמש כתבנית לסינתזה של ה־lagging strand, וכך מתאפשרת השלמה גם של הצד השני — לא באופן מלא, אך במידה מספקת.

מבנה הטלומר - לולאת ה־T-Loop

The Shelterin complex protects the telomere and suppresses the DNA repair response to DSBs

הקצה החד־גדילי הפתוח מהווה אות אזהרה לתא - הוא עלול להיות מזוהה כשבר DNA דו־גדילי, כ־DNA ויראלי זר, ואז מופעל מנגנון תיקון שיחבר כרומוזומים יחד (מה שאינו רצוי). כדי למנוע זאת:

  1. ה־overhang החד־גדילי מתקפל חזרה על עצמו.
  2. הוא פולש לתוך האזור הדו־גדילי של הטלומר וסוגר לולאה (T-loop) על־ידי יצירת מבנה תלת־גדילי (D-loop).
  3. הלולאה הזאת סוגרת את הקצה הפתוח - אין יותר קצוות חשופים.

קומפלקס השלטרין (Shelterin)

מכיוון ש־DNA חשוף אינו יציב בתא, קומפלקס חלבוני שנקרא Shelterin מתיישב על ה־T-loop ומייצב אותו. הוא כולל: TRF1, TRF2, RAP1, ועוד. הקומפלקס:

  • מייצב את מבנה ה־T-loop.
  • מכניס את כל אזור הטלומר למצב הטרוכרומטין.
  • ההטרוכרומטין חודר גם לאזור הסאב־טלומרי - גנים הסמוכים לטלומר עוברים השתקה כתוצאה מכך.

ביומרקר להתקצרות טלומרים: כאשר הטלומר מתקצר, נפרק מבנה ה־T-loop ומצב ההטרוכרומטין. גנים שנמצאים באזור הסאב־טלומרי מתחילים להתבטא - דבר שנקשר לתופעות של הזדקנות.

פיוזן טלומרים (Telomere Fusion)

כאשר מבנה ה־Shelterin / T-loop אינו תקין, הקצוות החשופים עוברים “תיקון” על־ידי מנגנוני תיקון DNA - ומתחברים לכרומוזומים אחרים. תופעה זו נקראת איחוי טלומרים (Telomere Fusion) ועלולה להתרחש:

  • בין שתי הכרומטידות האחיות של אותו כרומוזום ← נקודה אחת במקום שתיים בצביעה.
  • בין כרומוזומים שונים ← כרומוזומים מחוברים זה לזה.

כאשר תאים עם פיוז’ן כזה מנסים לבצע סגרגציה במיטוזה, נוצרים Anaphase Bridges - הכרומוזומים הקשורים נמתחים לאורך ציר הספינדל עד לשבירה, דבר שמוביל לאי־יציבות גנומית.

תפקיד נוסף: איפשור מתח פיתולי

סגירת קצות הכרומוזום במבנה ה־T-loop מונעת תנועה חופשית של הקצוות. כך ניתן להכניס מתח פיתולי לתוך המולקולה - תנאי הכרחי לתפקוד ה־DNA ולרפליקציה.

טלומרים, תאי גזע וסרטן

  • תאי גזע: טלומרז פעיל - שומר על אורך הטלומרים. ברגע שתא יוצא ממצב תא גזע ומתחיל התמיינות, הביטוי של הטלומרז נסגר ולתא יש מספר חלוקות מוגבל. זה מנגנון בקרה שמונע חלוקה אינסופית.
  • תאים ממוינים שאינם מתחלקים (כגון תאי עצב בוגרים): הבעיה פחות רלוונטית - לאחר שהגיעו למצבם הסופי, הם אינם מתחלקים.
  • סרטן: תאים סרטניים צריכים לצבור כ־7 מוטציות. אחת התופעות השכיחות בתאים סרטניים היא הפעלה מחדש של טלומרז - מה שמקנה להם יכולת חלוקה בלתי מוגבלת / אימורטליות. לדוגמה: תאי HeLa. ולכן טלומרז הוא מטרה טיפולית אפשרית - פגיעה ספציפית בו תפגע בתאים סרטניים פחות מאשר בתאים נורמליים.

טופואיזומראז (Topoisomerase)

In the absence of topoisomerase, the DNA cannot rapidly rotate, and torsional stress builds up

טופואיזומראזות הן אנזימים שיודעים לשנות את ה־Linking Number (Lk) של ה־DNA, ובכך לשנות את הטופולוגיה שלו. הן הוזכרו כבר בהקשר של הרפליקציה - כאשר ההליקאז פותח את הדו־גדיל, נוצר לפניו positive supercoiling שחייב להיפתר, אחרת הרפליקציה תיעצר.

מה מייחד טופואיזומראז מאנדונוקלאז? אנדונוקלאז חותך את ה־DNA ומשחרר את הקצוות - כל המתח הפיתולי משתחרר מיד ו־Wr מתאפס. טופואיזומראז לעומת זאת: חותך את ה־DNA אך ממשיך להחזיק את הקצוות - לא נותן לכל המתח להשתחרר בבת-אחת, אלא משחרר אותו בצורה מבוקרת, ואז סוגר מחדש את החיתוך.

סוגי טופואיזומראזות

Classification of DNA topoisomerases.

סוג I - חיתוך חד־גדילי:

  • חותך גדיל אחד בלבד.
  • מאפשר סיבוב של גדיל אחד ביחס לשני.
  • משנה את Lk ב±1 בכל מחזור פעולה.
  • אינו דורש ATP - עובר ממצב אנרגטי גבוה (supercoiled) למצב אנרגטי נמוך (relaxed).

סוג II - חיתוך דו־גדילי:

  • חותך שני הגדילים (דו־גדיל שלם).
  • מעביר דו־גדיל אחר דרך החיתוך.
  • משנה את Lk ב±2 בכל מחזור פעולה.
  • דורש ATP - לא לשחרור המתח (שגם הוא אנרגטי), אלא לשינויי קונפורמציה הנדרשים להעברת הדו־גדיל בתוך החלבון.

חריג: האנזים Gyrase (בחיידקים) - טופואיזומראז מסוג II שיודע לעשות את הכיוון ההפוך: ממצב relaxed למצב של negative supercoiling. דורש ATP (מצב אנרגטי גבוה). אין לו שקול ישיר באוקריוטים.

מנגנון פעולה - Type I

פעילות טופואיזומראז - טירוזין

עקרון הפעולה של הטופואיזומראז טמון בשיירת טירוזין באתר הפעיל שלו. לטירוזין יש טבעת עם קבוצת הידרוקסיל בקצה - הדומה במידה מסוימת לנוקלאוטיד.

מחזור הפעולה:

  1. התקפה נוקלאופילית: קבוצת ה־OH של הטירוזין תוקפת את השלד הפוספוסוכרי ומבצעת הידרוליזה - שוברת את הקשר בין שני נוקלאוטידים סמוכים.
  2. יצירת קשר קוולנטי זמני: הטירוזין נקשר קוולנטית לקצה 3’ (או 5’, תלוי בסוג) של ה־DNA - הטופואיזומראז ממשיך להחזיק את הקצה.
  3. שחרור Tw: כעת ניתן לסובב גדיל אחד ביחס לשני - הקצה החופשי מבצע סיבוב, ומשחרר Tw אחד (שינוי Lk של 1). האנרגיה נשמרת בקשר הקוולנטי עם הטירוזין.
  4. סגירה מחדש: ה־OH החופשי תוקף בחזרה את הקשר בין הטירוזין לשלד, מחזיר את קשר הפוספודיאסטר ומשחרר את הטירוזין. ללא צורך בליגז וללא צורך ב־ATP - האנרגיה נשמרה לאורך כל התהליך.

עיקרון חשוב: הטופואיזומראז עובד במחזורים - כל מחזור משחרר Tw אחד. אם משאירים אותו זמן רב עם DNA מסופרקוייל, הוא ימשיך לעבוד עד שהדו־גדיל יגיע למצב ה־Relaxed (Wr=0), שהוא המינימום האנרגטי.

מנגנון פעולה - Type II (Two-Gate Model)

Topo II two-gate model

טופואיזומראז II עובד על שני דו־גדילים - חותך אחד ומעביר דרכו את השני:

  1. קישור: האנזים תופס שני דו־גדילים - ה”שייר” (G-segment) שייחתך, וה”מעביר” (T-segment) שיועבר דרכו.
  2. שינוי קונפורמציה (ATP): קישור של שתי מולקולות ATP סוגר את השער העליון ופותח את השער התחתון - האנזים שינה קונפורמציה.
  3. חיתוך: ה־G-segment נחתך בשני הגדילים, הקצוות מוחזקים על־ידי הטירוזינים.
  4. מעבר: ה־T-segment מועבר דרך החיתוך - דו־גדיל שלם עבר דרך דו־גדיל שלם אחר.
  5. סגירה: ה־G-segment נסגר מחדש; שני הדו־גדילים משתחררים.
  6. תוצאה: Lk השתנה ב־±2 (שני גדילים עברו).

הידרוליזה של ATP ל־ADP: נדרשת לשינויי הקונפורמציה (פתיחה/סגירה של השערים) ולא לשחרור המתח הפיתולי עצמו.

סיכום - השוואת סוגי טופואיזומראז

  Type I Type II
סוג החיתוך חד־גדילי דו־גדילי
מה משתנה Tw Wr
שינוי ב־Lk ±1 ±2
צורך ב־ATP לא כן (לשינוי קונפורמציה בלבד)
ציר הפעולה גדיל אחד מסתובב דרך שבר דו־גדיל עובר דרך דו־גדיל

קשר לסרטן ולרפואה

מחלות הקשורות לרפליקציה ולאנזימים

  • מחלות של DNA פולימראז: מוטציות ב־Pol ε ו־Pol δ - פגיעה ב־Proofreading ← הצטברות מוטציות ← סרטן.
  • Werner Syndrome: מוטציה בגן WRN1 (הליקאז). ההליקאז משמש גם בתיקון DNA וגם ברפליקציה - תקלה בו ← הזדקנות מוקדמת ונטייה לסרטן.
  • Bloom Syndrome: מחלה גנטית תורשתית, שכיחה ביהודים אשכנזים - פגיעה בהליקאז, נטייה גבוהה לסרטן בגיל צעיר.
  • Cornelia de Lange Syndrome: קשור לקוהיזין.
  • מחלות Trinucleotide Repeat: Fragile X, Huntington - נדונו בשיעור הקודם.

טרגטינג של מרכיבי הרפליקציה בטיפול בסרטן

  • מעכבי טופואיזומראז: מטרה חשובה בכימותרפיה - עוצרים רפליקציה ב־DNA של התאים הסרטניים המתחלקים הרבה יותר מהר.
  • פלטינום (Cisplatin ונגזרות): יוצר קרוסלינקינג קוולנטי בין גדילי ה־DNA - ה־DNA פולימראז אינו יכול לעבור את ה”חסם”.
  • אנלוגים של נוקלאוטידים: חוסמים את ה־DNA פולימראז בכניסה.
  • מעכבי טלומרז: מטרה אטרקטיבית כיוון שטלומרז פעיל בתאים סרטניים אך לא ברוב התאים הנורמליים.

האתגר: ספציפיות - רוב התרופות הנ”ל פוגעות גם בתאים נורמליים המתחלקים (מעי, שיער, מח עצם) ומייצרות תופעות לוואי. הפתרון: טרגטינג מקומי לגידול ספציפי, בייחוד לפני שהפך לגרורתי.

PCR ויישומים מעבדתיים-קליניים

PCR בסיסי

עקרון הריאקציה: טמפלייט + פריימרים + dNTPs + DNA פולימראז. בכל מחזור - דנטורציה (95°C), היברידיזציה (כ־55–65°C), סינתזה (72°C). הכפלה אקספוננציאלית: 2ⁿ מולקולות לאחר n מחזורים.

הטריק המרכזי: שימוש ב־Taq פולימראז מ־Thermus aquaticus - חיידקים ממעיינות חמים (Yellowstone) שעמידים ב־95°C. הרעיון של קארי מוליס (פרס נובל 1993): אנזים עמיד-חום שאינו עובר דנטורציה בכל מחזור.

גודל מקסימלי ב־PCR סטנדרטי: ~3,000–5,000 בסיסים; עם אנזים מיוחד עם Proofreading - עד כ־10,000 בסיסים.

יישום קליני - מחלות Trinucleotide Repeat: ניתן לקחת דגימת דם, להפיק DNA ופשוט למדוד את אורך המקטע כדי לדעת את מספר החזרות. למשל Fragile X - מספר חזרות CGG מעל 200 ← פתולוגי.

qPCR (Quantitative PCR)

מאפשר מידע כמותי - לא רק “כן/לא” אלא כמה עותקים (טיטר וירלי). מנגנון: שימוש ב־SYBR Green (קושר ספציפית ל־dsDNA) - מודד פלואורסנציה בכל מחזור. כיוון שפלואורסנציה פרופורציונלית למספר המולקולות, ניתן לחשב כמות.

יישום קליני: קורונה, שפעת וירוסי RNA אחרים - עם RT-PCR (Reverse Transcription + PCR): הרוורס טרנסקריפטאז הופך RNA → cDNA, ואז PCR סטנדרטי.

שיטת סנגר לריצוף DNA (Sanger Sequencing)

עיקרון: PCR עם תוספת ddNTPs (Dideoxynucleotides) - דומים ל־dNTPs אך חסרה קבוצת 3’-OH. אם ddNTP נכנס, הסינתזה נעצרת (אין 3’-OH להמשך שרשרת). בריכוז נמוך של ddNTPs, הריאקציה נעצרת באופן אקראי בכל מיקום ← מתקבלות מולקולות בכל האורכים. הפרדה קפילרית לפי גודל + צביעה פלואורסנטית לפי בסיס ← שחזור הרצף.

  • אורך קריאה מקסימלי: כ־1,000 בסיסים (ה־100–200 הראשונים בדרך כלל באיכות נמוכה).
  • זמן: בערך שעתיים, מכשיר קטן.
  • יישום קליני: מוטציות נקודתיות, רצפים ויראליים ידועים, אימות מחלות גנטיות ספציפיות.

NGS - Next Generation Sequencing (Illumina)

מאפשר ריצוף גנום שלם:

  1. שבירה מכנית (סוניקציה) ל־כ־500 bp.
  2. חיבור אדפטורים (רצפים סינתטיים ידועים + אינדקסים להבדלת דוגמאות).
  3. היברידיזציה על צ’יפ עם פריימרים משלימים לאדפטורים.
  4. Bridge Amplification - יצירת קלאסטרים של ~200 מולקולות זהות.
  5. Reversible Terminator Sequencing - כימיה הפיכה: נוקלאוטיד פלואורסנטי נכנס ← צילום ← שחרור כימי ← כניסת הבסיס הבא.
  6. Bioinformatics: יישור כל המקטעים לגנום ייחוס ← שחזור הרצף המלא.
  • כיסוי: 90%+ מהגנום; בעיה ברצפים חוזרים (לא ניתן למקם אותם בוודאות).
  • מחיר: פחות מ־$1,000 לגנום שלם כיום.

יישום קליני: Whole Exome Sequencing (WES) לאבחון מחלות גנטיות; כאשר יש תינוק עם פיזיולוגיה לא מוסברת, WES הוא כלי האבחון העוצמתי ביותר.

Oxford Nanopore - הדור הבא

מבוסס על מדידה חשמלית של DNA שעובר דרך ממברנה - כל נוקלאוטיד יוצר התנגדות חשמלית שונה. יתרונות:

  • קריאות ארוכות מאוד (כ־50,000–100,000 בסיסים) ← פתרון בעיית הרצפים החוזרים.
  • מאפשר קריאת מודיפיקציות (מתילציה, אפיגנטיקה) ישירות מה־DNA - ללא שלבים נוספים.

עדיין אינו בשימוש קליני שגרתי; עיקר השימוש בו כיום הוא במחקר, אך בעתיד הוא עשוי להפוך לכלי זמין גם במרפאת רופא משפחה.

דור פסקל
חזור לשיעור הקודם
חזור לעמוד הקורס