אלקטרופורזה בג’ל (SDS-PAGE)

עקרונות בסיסיים

  • SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - דטרגנט יוני שמרכיב הכימי כולל:
    • קבוצת סולפט ($\text{SO}_4^-$)
    • שרשרת ארוכה של פחמנים (חלק הידרופובי)
  • SDS הורס את המבנה הקוואטרנרי של החלבון ומנטרל את הצורה הנטיבית
  • החלבונים נפרסים לשרשראות ליניאריות

תכונות SDS

  • יחס קבוע: מולקולת SDS אחת נקשרת לכל 2 חומצות אמינו
  • נותן לכל החלבונים צפיפות מטענית שווה (שלילית)
  • מנטרל את המטענים הנטיביים של החלבון
  • החלבונים נעים רק לפי משקל מולקולרי

חומרים מחזרים

תמיד מוסיפים חומרי חיזור כמו:

  • DTT (Dithiothreitol)
  • β-mercaptoethanol

שתי סיבות להוספת חומרים מחזרים:

  1. חלבונים עם קשרי דיסולפיד: פירוק הקשרים ליצירת שרשרת אחת מקופלת
  2. חלבונים עם ציסטאינים חופשיים: מניעת יצירת קשרי דיסולפיד לא ספציפיים שגורמים לאגרגציה

הליך העבודה

  • חימום הדגימה ב-SDS למשך 5 דקות (דנטורציה מלאה)
  • ההרצה מתבצעת בזרם חשמלי
  • גודל הנקבוביות בג’ל קובע את מהירות הריצה ויכולת ההפרדה

קביעת משקל מולקולרי

  1. הרצת מרקר - תערובת חלבונים במשקלים ידועים
  2. מדידת מרחק הנדידה לאחר זמן נתון
  3. יצירת גרף סמי-לוגריתמי: נפח אלוציה vs. log(משקל מולקולרי)
  4. קבלת קו ישר והערכת משקל החלבון הלא ידוע

הערה חשובה: זהו המשקל הדנטורטיבי (שרשרת אחת). אם החלבון הנטיבי הוא אוליגומר (למשל דיימר), יראה משקל שונה בשיטות נטיביות.

ג’ל דו-ממדי (2D Gel Electrophoresis)

ממד ראשון - הפרדה לפי pI

  • הרצה על פס עם גרדיאנט pH (למשל pH 3-9)
  • כל חלבון נע עד שמגיע ל-pI שלו (נקודה איזואלקטרית)
  • ב-pI: המטען נטו = 0, החלבון עוצר
  • הרצה נטיבית (בצורה המקופלת)

ממד שני - הפרדה לפי גודל

  • סיבוב הג’ל ב-90° והנחה על ג’ל SDS-PAGE
  • הרצה דנטורטיבית לפי משקל מולקולרי
  • תוצאה: נקודות המייצגות חלבונים שונים

יישום: הפרדה של חלבונים עם משקל מולקולרי שונה אך אותו pI

צביעה וזיהוי

שיטות צביעה

  1. Coomassie Brilliant Blue (CBB) - צביעה סטנדרטית
  2. Silver Stain - רגישות פי-10 יותר גבוהה, יקרה יותר

Western Blot

  • העברת חלבונים מהג’ל לממברנת ניטרוצלולוז
  • זיהוי חלבון ספציפי באמצעות נוגדנים
  • רגישות גבוהה - רואים רק את החלבון המבוקש גם בדגימה “מלוכלכת”

ריצוף חלבון

  • גזירת בנדים מהג’ל
  • שליחה לניתוח בספקטרוסקופיית מסה (Mass Spectrometry)
  • זיהוי וריצוף החלבון

הפרדה והיזוק חלבונים

שלבים ראשונים

  1. שבירת תאים - שיטות מכניות + דטרגנטים עדינים (לא SDS)
  2. צנטריפוגה (centrifugation) - הפרדת:
    • פלט (pellet): חומר לא מסיס, ממברנות
    • סופרנטנט (supernatant): חלבונים מסיסים בנוזל הציטופלזמי

שקיעה סלקטיבית (Selective Precipitation)

עקרונות

  • שימוש בתכונות המסיסות של חלבונים
  • pI = נקודת המסיסות הנמוכה ביותר
    • ב-pI: מספר שווה של מטענים חיוביים ושליליים
    • אינטראקציות אלקטרוסטטיות בין חלבונים → קלסטרינג ושקיעה
  • משתנים: pH וריכוז מלח

השפעת מלח

Salting In (ריכוזי מלח נמוכים):

  • יצירת מיסוך יוני על מטעני החלבון
  • מעטפת הידרציה טובה יותר
  • עלייה במסיסות

Salting Out (ריכוזי מלח גבוהים):

  • תחרות בין יוני המלח לחלבון על מולקולות מים
  • החלבון נשאר ללא מעטפת הידרציה
  • אגרגציה ושקיעה

דיאליזה (Dialysis)

עקרון הפעולה

  • שקית עם cut-off מסוים (למשל 25 kDa)
  • ממברנה חדירה למחצה
  • דיפוזיה של מולקולות קטנות מהשקית החוצה
  • מולקולות גדולות נשארות בשקית

יישומים

  1. דילול מולקולות קטנות - מספר מחזורי דיאליזה (בדרך כלל 3)
  2. החלפת באפר - דיאליזה נגד באפר חדש

הערה: בחירת cut-off לפחות במחצית משקל החלבון המבוקש

כרומטוגרפיה

עקרון כללי

העברת דגימה דרך פאזה נייחת (stationary phase) עם תכונה ספציפית

1. Size Exclusion Chromatography (SEC) / Gel Filtration

מבנה הקולומנה

  • כדוריות (beads) עשויות פולימר אינרטי
  • הכדוריות בנויות כרשת ספוגית

מנגנון ההפרדה (counter-intuitive!)

  • חלבונים גדולים: לא נכנסים לרשתות → עוברים בין הגרגירים → רצים מהר → יוצאים ראשונים
  • חלבונים קטנים: נכנסים לרשתות → מסתבכים → עושים דרך ארוכה → רצים לאט → יוצאים מאוחרים

איסוף ומדידה

  • איסוף פרקציות במרווחי זמן קבועים
  • מדידה: elution volume או elution time
  • הרצה בג’ל אלקטרופורזה לזיהוי החלבון

הערכת משקל מולקולרי

  • הרצת חלבוני סטנדרט (משקלים ידועים)
  • יצירת גרף: elution volume vs. log(MW)
  • השוואה למדידה ב-SDS-PAGE

אזהרה: השוואה תקפה רק לחלבונים גלובולריים. חלבון מוארך ירוץ כמו חלבון גדול יותר (רדיוס הידרודינמי גדול).

2. Ion Exchange Chromatography (מחליף יונים)

עקרונות מטען

  • בכל חלבון ב-pH נתון: פוטנציאל מטעני מסוים
  • pH נמוך → מטען חיובי
  • pH = pI → מטען נטו = 0
  • pH גבוה → מטען שלילי

סוגי מחלפי יונים

  1. Cation Exchange - beads טעונים שלילית, קושרים חלבונים חיוביים
  2. Anion Exchange - beads טעונים חיובית, קושרים חלבונים שליליים

הליך ההפרדה

  1. טעינת הדגימה על הקולומנה
  2. חלבונים עם מטען מתאים נקשרים (חוזק קישור תלוי במספר המטענים)
  3. חלבונים עם מטען הפוך שוטפים
  4. אלוציה בגרדיאנט מלח:
    • ריכוז נמוך → שחרור חלבונים קשורים חלש
    • ריכוז גבוה → שחרור חלבונים קשורים חזק
  5. יוני המלח מחליפים את החלבון כקטיון או אניון על הקולומנה

3. Affinity Chromatography (כרומטוגרפיית זיקה)

עקרון

ניצול זיקה ספציפית של החלבון לליגנד מסוים

דוגמה: חלבון הקושר גלוקוז

  1. beads עם מולקולות גלוקוז קשורות
  2. העברת תערובת חלבונים
  3. רק החלבון הקושר גלוקוז נקשר
  4. שאר החלבונים שוטפים

שיטות אלוציה

א. אלוציה תחרותית (Competitive Elution)

  • הוספת גלוקוז חופשי בריכוז גבוה
  • תחרות על הליגנד הקשור
  • הסטת שיווי משקל → החלבון יוצא קשור לגלוקוז חופשי

ב. אלוציה לא-ספציפית

  • שינוי pH (חומצי/בסיסי קיצוני)
  • הוספת מלח בריכוז גבוה
  • חומרים דנטורנטים (urea, guanidine)
  • חיסרון: עלול להרוס את החלבון והליגנד

ג. תחרות על הליגנד

  • מולקולה חוסמת את הליגנד במקום החלבון
  • החלבון משתחרר חופשי (ללא ליגנד)

דוגמה מיוחדת: נוגדן-אנטיגן

  • קישור חזק מאוד
  • בדרך כלל דורש pH נמוך (~2) לשחרור
  • נוגדנים יציבים ושורדים תנאים קיצוניים

המוגלובין ומיוגלובין

חשיבות נשאי חמצן

בעיית המסיסות

  • $\text{O}_2$ הוא מולקולה לא פולארית ($\Delta = 0$)
  • מסיסות נמוכה במים: ~0.15 mM באיזון עם אוויר
  • $\text{CO}_2$ ו-$\text{NH}_3$ מסיסים פי-30 יותר (מולקולות פולאריות)

פתרון אבולוציוני

  • מעבר מחיים במים ליבשה → צורך בהסעת חמצן למרחקים
  • דיפוזיה לבד אינה יעילה למרחקים ארוכים
  • פיתוח נשאי חמצן: המוגלובין ומיוגלובין

השפעת נשאי חמצן

  • ללא המוגלובין: מסיסות O₂ = 5 mL/L
  • עם המוגלובין: מסיסות O₂ = 250 mL/L
  • עלייה פי-50 במסיסות!

תכונות נשא

  1. קישור לחומר הנישא בתנאים מסוימים (בריאות)
  2. שחרור החומר בתנאים אחרים (ברקמות)
  3. קישור לא-קובלנטי והפיך

מבנה המוגלובין/מיוגלובין

רכיבים

  • גלובין - החלבון
  • קבוצה פרוסתטית - Heme (תרכובת porphyrin)

Heme - מבנה ותכונות

מבנה:

  • 4 טבעות פירול המחוברות במבנה מחזורי
  • אטום ברזל ($\text{Fe}^{2+}$) במרכז
  • הברזל נקשר ב-4 קשרים קואורדינטיביים לחנקנים של הפירולים

קשרים קואורדינטיביים:

  • קשר שבו שני האלקטרונים מגיעים מאותו אטום
  • הברזל מקבל זוג אלקטרונים מכל חנקן
  • שני מקומי קישור נוספים לברזל:
    1. קישור להיסטידין פרוקסימלי (F8)
    2. מקום פנוי/קישור ל-$\text{O}_2$ או מים

מבנה תלת-ממדי

מיוגלובין:

  • מונומר (שרשרת יחידה)
  • 8 α-helices
  • 153 חומצות אמינו
  • כיס הידרופובי לקבוצת Heme
  • משקל: ~17 kDa

המוגלובין:

  • טטרמר: $\alpha_2\beta_2$
  • שתי שרשראות α (141 a.a. כל אחת)
  • שתי שרשראות β (146 a.a. כל אחת)
  • 4 קבוצות Heme (אחת לכל תת-יחידה)
  • משקל: ~64 kDa

קישור חמצן

מצבי חמצון

  • Ferrous ($\text{Fe}^{2+}$) - קושר $\text{O}_2$ באופן הפיך ✓
  • Ferric ($\text{Fe}^{3+}$) - לא יכול לקשור $\text{O}_2$ ✗

הסביבה ההידרופובית

  • כיס Heme הידרופובי מגן על הברזל
  • מונע חמצון ל-$\text{Fe}^{3+}$
  • מאפשר קישור הפיך של $\text{O}_2$

היסטידינים קריטיים

  1. His F8 (פרוקסימלי): קושר ישירות לברזל
  2. His E7 (דיסטלי): מייצב את $\text{O}_2$ הקשור, מונע קישור של CO

המשך יבוא בשיעור הבא

  • עקומות קישור חמצן
  • Cooperativity
  • אפקט Bohr
  • 2,3-BPG
  • הבדלים תפקודיים בין מיוגלובין להמוגלובין

מונחים נוספים:

  • Native - נטיבי (צורה טבעית)
  • Denatured - דנטורטיבי (צורה מפורקת)
  • Elution - אלוציה (יציאה מקולומנה)
  • Ligand - ליגנד (מולקולה נקשרת)
  • Prosthetic group - קבוצה פרוסתטית
דור פסקל
חזור לשיעור הקודם