שיעור 13 ציר ימין-שמאל, ‏Nodal Flow והתפתחות הלב

למה ציר ימין-שמאל נדרש

אחרי שלמדנו cleavage, גסטרולציה ותחילת אורגנוגנזה, השיעור הנוכחי נחזור לשאלה כללית יותר: איך העובר קובע את ציר ימין-שמאל.

הציר הזה נותן לתוכנית האורגנוגנזה מערכת קואורדינטות. איברים פנימיים כמו הלב, הריאות, הכבד, הקיבה והטחול צריכים להתמקם ולבצע מורפוגנזה לפי צד מוגדר. כשקביעת הציר נפגעת, מתקבלים left-right axis defects או laterality defects: דקסטרוקרדיה, סיטוס אינברסוס, ‏right isomerism, ‏left isomerism ופגמים נוספים במיקום ובמבנה של איברים.

המודל שנבנה בשיעור מתחיל מהלב, כי הלב הוא אחד האיברים הראשונים שבהם רואים בבירור תוצאה מורפולוגית של ציר ימין-שמאל: ה־heart tube מתחיל כצינור סימטרי, ובהמשך עובר rightward looping.

התפתחות ראשונית של הלב

שכבות הלב

בלב הבוגר מבחינים במספר שכבות עיקריות:

ה־Endocardium הוא אנדותל. הוא נוצר מתאי אנדותל של המערכת הווסקולרית, ולא מה־cardiogenic crescent של תאי השריר. ה־Myocardium נוצר מתאים קרדיוגניים שיתמיינו לקרדיומיוציטים.

מה־cardiac crescent ל־heart tube

בתחילת ההתפתחות הקרדיוגנית, תאים קרדיוגניים נעים דרך ה־Primitive Streak ומתמקמים קדמית מאוד, לפני האזור הרוסטרלי של ה־Neural Plate. כך נוצר מבנה דמוי פרסה שנקרא cardiac crescent.

בשלבים הבאים מתרחשים קיפולים ותנועה מרחבית של העובר:

1. ה־cardiac crescent נמצא קדמית מאוד יחסית למוח המתפתח.
2. קיפול אנטריורי-פוסטריורי וקיפול לטרלי (Lateral folding), מביאים את אזור הלב (cardiac crecent) למיקום החזי (כתוצאה מקיפול האנדודרם).
3. שני השדות הקרדיוגניים, מימין ומשמאל, מתקרבים זה לזה.
4. תאי אנדותל יוצרים צינורות פנימיים שיהפכו ל־Endocardium.
5. תאי ה־Myocardium מתארגנים מסביב.
6. בין ה־Endocardium ל־Myocardium מצטבר cardiac jelly - מטריקס חוץ־תאי שמופרש בעיקר מתאי ה־Myocardium.
7. שני הצדדים מתאחים ונוצר heart tube אחד במרכז (איור D מתאר את תחילת התהליך).

ה־cardiac jelly חשוב לסידור המרחבי של הלב; הוא יוצר מרווח שבו יכולים להתקיים סיגנלים בין ה־Endocardium ל־Myocardium, ובהמשך מאפשר גמישות טופוגרפית בזמן שינויי הצורה של הלב.

Heart tube ו־rightward looping

ה־heart tube הראשוני הוא צינור סימטרי שנמצא במרכז. בשלב הבא הצינור עובר rightward looping. הכיוון הזה קבוע בהתפתחות תקינה, והוא ממקם את הלב באופן שמתאים לציר ימין-שמאל.

בתרשים של ה־heart tube אחרי looping:

• החלקים העליונים יתרמו ל־outflow tract.
• אזורים שונים לאורך הצינור יתרמו ל־right ventricle, ‏left ventricle ול־atria.
• ה־looping מקשר בין צורת הצינור הראשונית לבין הארגון הא-סימטרי של הלב הבוגר.

ביטוי א-סימטרי של Nodal, ‏Lefty ו־Pitx2

קביעת ציר ימין-שמאל מתרחשת סביב שלב ה־Node ובשלבים מוקדמים של הסומיטים. נבחנים בעיקר עוברים בין שלב ה־Headfold לבין שלבי הסומיטים הראשונים.

Nodal סביב ה־Node וב־LPM

במהלך הגסטרולציה יש ל־Nodal תבנית ביטוי מוקדמת ודינמית. בהמשך, סביב שלב ה־Headfold, הביטוי הכללי הזה נעלם, ובאזור ה־Node מופיעה תבנית חדשה:

1. בתחילה Nodal מתבטא בשני צידי ה־Node, בצורה יחסית סימטרית.
2. בהמשך הביטוי סביב ה־Node נעשה חזק יותר בצד שמאל.
3. לאחר מכן מופיע ביטוי ברור של Nodal בצד שמאל של ה־lateral plate mesoderm (LPM).
4. הביטוי ב־LPM זמני: הוא מופיע בחלון התפתחותי מוקדם ובהמשך נעלם.

הצביעה היא in situ hybridization, ולכן היא מציגה RNA ולא חלבון.

Lefty1, ‏Lefty2 ו־Pitx2

באותו חלון התפתחותי מופיעים גנים נוספים בתבנית א-סימטרית:

הציר נבנה כמערכת שבה:

• Nodal מפעיל תוכנית שמאלית
• Lefty מגביל את התוכנית הזאת ומונע התפשטות לא נכונה
• Pitx2 משתתף בתוכנית ההתפתחותית של איברים בצד שמאל.

Nodal signaling ו־Cre/loxP

Nodal signaling

Nodal שייך ל־TGF-β superfamily. הוא נוצר תחילה כ־Pro-Nodal בעל פעילות נמוכה, ואז עובר ביקוע על ידי convertases כמו Furin או PACE4.

לאחר העיבוד:

1. Nodal נקשר לרצפטורים ממשפחת TGF-β.
2. נדרש co-receptor ממשפחת EGF-CFC (לעניינו, Cripto).
3. מופעלים SMAD2/3.
4. SMAD2/3 עובדים עם SMAD4 ‏(co-smad).
5. הקומפלקס נכנס לגרעין ומפעיל שעתוק.

Lefty1/2 שייכים גם הם למשפחת TGF-β, אך הם פועלים כמעכבים של Nodal. הם נקשרים ל־Nodal ומונעים ממנו להפעיל את הרצפטור. מכיוון ש־Nodal signaling מפעיל גם את Lefty1/Lefty2, מתקבל negative feedback loop.

למה משתמשים ב־Conditional Knockout

Knockout מלא של Nodal פוגע כבר בשלבים מוקדמים של הגסטרולציה. כדי לבדוק את התפקיד שלו בציר ימין-שמאל (שלב מאוחר), צריך למחוק אותו רק לאחר שלבים מוקדמים יותר. לכן משתמשים ב־conditional knockout - פגיעה שמצומצמת רק לתאים מסוימים, ורק לנקודת זמן מסוימת.

המערכת מבוססת על Cre/loxP:

בנוסף לכך, נדרש לייצר עכבר עם שלושה אקסטנים, שנוכל לתחום בין שני אתרי loxP את האזור הקריטי של הגן. כך מתקבל floxed allele. לאחר ביטוי Cre, הרצף הקריטי שבין שני אתרי loxP יוצא החוצה, ומתקבל deleted allele.

הוספת האינטרונים עצמה משאירה את הגן פונקציונלי, כך שעד לביטוי Cre, העכבר עם ה־floxed allele הוא פנוטיפית WT לחלוטין.

ביטוי Cre תחת promoter מתאים מאפשר לבצע מחיקה ברקמה מסוימת או בזמן התפתחותי מסוים.

Nodal loss of function

ב־Nodal conditional knockout, ה־Nodal נמחק אחרי הגסטרולציה כדי לבדוק את תפקידו בציר ימין-שמאל.

השפעה על גני מטרה

כאשר Nodal signaling חסר בשלב הזה:

• Lefty1 לא מתבטא ב־midline.
• Lefty2 לא מתבטא ב־left LPM.
• Pitx2 לא מתבטא ב־left LPM.

Nodal signaling ממוקם upstream ל־Lefty1, ‏Lefty2 ו־Pitx2 בהקשר של קביעת ציר ימין-שמאל, היינו, מאפשר ביטוי שלהם. מדובר ב־Negative feedback loop: ה־Nodal מפעיל את Lefty, ו־Lefty מעכב את Nodal.

השפעה על heart tube looping

ב־WT, ה־heart tube עובר rightward looping. במוטנטים של Nodal מתקבלת רנדומיזציה של כיוון ה־looping: בחלק מהעוברים הכיוון תקין, ובכמחצית מתקבל reversed looping (אזי הכיוון רנדומלי).

המשמעות ההתפתחותית היא שה־heart tube עדיין מבצע תוכנית מורפוגנטית, אך בלי Nodal (בשלב המתאים, עוד לפני כן לצורך העניין), הכיוון שלה כבר לא מוגדר באופן יציב.

פנוטיפים בלב ובריאות

ביחס ללב, אחד הביטויים של פגיעה בציר ימין-שמאל הוא dextrocardia: קודקוד הלב (apex) פונה ימינה במקום שמאלה. בניסוי של הזרקת נוזל גם ראו בעיה בספטום.

ביחס לריאות, בריאות של עכבר WT יש א-סימטריה ברורה:

• ריאה שמאלית: אונה אחת.
• ריאה ימנית: ארבע אונות.

ב־Nodal loss of function מתקבל right isomerism: לשני הצדדים יש מאפיינים של ריאה ימנית.

מכאן ש־Nodal signaling קובע את התוכנית השמאלית. כאשר התוכנית השמאלית אינה מופעלת, שני הצדדים מקבלים מאפיינים ימניים (ברירת המחדל לכאורה ימנית).

Lefty1/Lefty2 והפרדת ימין משמאל

Midline barrier

כאשר צד שמאל של העובר מפעיל תוכנית מולקולרית שונה מצד ימין, יש צורך לשמור על הפרדה בין הצדדים. ה־midline משמש כמחסום שמונע מהתוכנית השמאלית להתפשט ימינה.

• Lefty1 מתבטא ב־midline ולכן מתאים לתפקיד הזה.
• Lefty2 מתבטא ב־left LPM ומעכב את Nodal בתוך הדומיין השמאלי עצמו.

Lefty1 loss of function

ב־Lefty1 loss of function, הביטוי השמאלי מתחיל, אבל הוא לא נשאר מוגבל לצד שמאל.

במוטנטים של Lefty1 רואים:

• Nodal יכול להופיע גם בצד ימין.
• Lefty2 יכול להופיע דו־צדדית.
• Pitx2 יכול להופיע בשני הצדדים.

הפנוטיפ האיברי המתאים הוא left isomerism: מאפיינים של צד שמאל מופיעים גם בצד ימין.

במוטנטים של Lefty1 יש גם פנוטיפים לבביים מגוונים. חלק מהלבבות נראים קרובים לתקין, וחלקם מראים פגמים משמעותיים במיקום ובחיבורי כלי הדם הגדולים.

סיכום ההבדל בין Nodal ל־Lefty

• Nodal מגדיר את התוכנית השמאלית.
• Lefty מגביל את התוכנית הזאת למיקום הנכון.

Laterality defects באדם

באדם משתמשים בכמה מונחים לתיאור סידור האיברים:

Laterality defects יכולים להופיע כמראה מלאה יחסית, כמו סיטוס אינברסוס, או כמערך מורכב יותר שבו איברים שונים מושפעים באופן שונה.

Kartagener syndrome והקשר לסיליות

Kartagener syndrome הוא מצב הקשור ל־primary ciliary dyskinesia (PCD). יש פגיעה בתנועת סיליות ברקמות שונות, למשל באפיתל הנשימתי ובמערכת הרבייה.

נבהיר שבמצב תקין, יש בתאי האפיתל במערכת הנשימה (בסימפונות, בסינוסים וכו׳) Primary cillia שנעות, במטרה להוציא מוקוס החוצה, וכך להגן על המערכות הריריות מפני זיהומים (סילוק פתוגנים). גם לפלג׳לה בתא הזרע יש סוג של primary cillia נעה.

המאפיינים העיקריים:

• פגיעה בתנועת סיליות נשימתיות ← נטייה לסינוסיטיס וברונכיאקטזיות.
• פגיעה בתנועת flagella של תאי זרע ← ייתכנו בעיות פוריות בגברים.
• במקרים רבים, בסיליות שאיבדו את יכולת התנועה חסרות dynein arms.
• בערך מחצית מהחולים מציגים סיטוס אינברסוס.

הקשר בין פגיעה בסיליות לבין סיטוס אינברסוס מוביל לשאלה, איך סיליות ב־Node משתתפות בקביעת ציר ימין-שמאל.

סיליות ו־Nodal Flow

הסיליות ב־Node

ב־Node יש primary cilia מסוג 9+0. באופן כללי, סיליות 9+0 הן בדרך כלל לא תנועתיות (בניגוד ל־9+2), אבל הסיליות של ה־Node הן חריגות: יש להן מנועי dynein שמאפשרים להן לנוע.

המאפיינים של סיליות ה־Node:

• הן יוצאות מהצד הפוסטריורי של התא (הזווית שלהן לכיוון האפיקלי היא פוסטריורית).
• פני השטח האפיקלי של התא מקומרים (״גבעה״).
• הסיליות מוטות פוסטריורית (כתוצאה מהנטייה על פני השטח האפיקלי).
• הן מסתובבות במהירות של בערך 600 סיבובים בדקה.
• הסיבוב הוא עם כיוון השעון כאשר מסתכלים מהצד הוונטרלי.

ההטיה הפוסטריורית ממירה סיבוב מקומי של הסיליה לזרם כיווני של נוזל. הזרם הזה נע על פני ה־Node מימין לשמאל ונקרא Nodal Flow. השם קשור למיקום שלו על פני ה־Node. הוא אינו זהה לגן Nodal או לחלבון Nodal.

המודל המתמטי המוצע

אם נחשב את זווית הנטייה של הסיליות, צפוי זרם של נוזלם לצד שמאל. עם זאת, תנועה סיבובית עם כיוון השעון, במהירות ובזווית הנתונים, לכאורה יוצרת שני וקטורים שמבטלים את השני:

• הווקטור השמאלי (מעל הסיליות), מסומן בתמונה בטורקיז.
• הווקטור הימני (מתחת לסיליות), מסומן בתמונה בסגול.

הסיבה שהווקטורים אינם מבטלים זה את זה היא שהווקטור הימני חלש מהשמאלי, בשל חיכוך עם התאים. מכאן שסך הכל הווקטור פונה שמאלה.

הוכחת הזרם והקשר ל־looping

כדי להדגים את הזרם, ניתן לשים beads פלואורסנטיים על פני ה־Node ולראות שהם נעים שמאלה, כמתואר מעלה.

כדי לבדוק אם יש בכלל קשר בין ה־Nodal flow לציר ימין-שמאל, ובפרט אם כיוון הזרם משפיע על ציר ימין-שמאל, השתמשו במערכת ניסויית שמפעילה זרם מלאכותי מעל עוברים.

עיקרון הניסוי:

• כשהמשאבה כבויה, הזרם הטבעי של הסיליות מניע את הנוזל שמאלה.
• זרם מלאכותי חזק יכול לכפות כיוון חדש, הפוך משל ה־Node (ראו באיור C).
• זרם מלאכותי ימינה יכול להפוך את כיוון ה־heart looping.
• זרם מלאכותי איטי לא בהכרח מתגבר על הזרם הטבעי של הסיליות.

בניסוי נוסף, משתמשים בעוברים מוטנטיים iv/iv. הסיליות ב־Node שלהן אינן תנועתיות, ולכן אין זרם טבעי. יש להם גם תסמינים של סיטוס אינברסוס. מתוצאות הניסוי (למטה) עולה שבכל המקרים, כיוון הזרם המלאכותי קובע את כיוון ה־looping.

• צבע כחול - נורמאלי (בספרות: “D-loop”), הלב התפתח בצד שמאל ופונה ימינה
• צבע ורוד - הפוך (בספרות: “L-loop”), הלב פונה שמאלה

להבנתי, ההבדל הוא גם במצב C (אין כיוון טבעי שיתגבר על זרם חלש), אבל בעיקר בעובדה שיש אחידות בקיפול הלב של העוברים המוטנטים. היה ניתן לצפות שכיוון הקיפול בעוברי iv/iv יהיה רנדומלי, אבל הניסוי מראה שכיוון הזרם החיצוני קובע את כיוון הלופינג.

הניסוי מחבר בין Nodal Flow לבין החלטת ימין-שמאל: כיוון הזרימה על פני ה־Node משפיע על התוכנית הא-סימטרית בעובר.

הגורם שקובע את ציר שמאל־ימין הוא כיוון זרימת הנוזל ב־Node, ולא עצם תנועת הריסונים. הריסונים הם פשוט המנוע שמייצר את הזרימה.

מודל שתי הסיליות, סידן ופוליציסטין

Pit cells ו־Crown cells

ב־Node מבחינים בין שתי אוכלוסיות תאים:

מודל שתי הסיליות מתאר חלוקת תפקידים:

1. סיליות תנועתיות ב־Pit cells יוצרות זרם שמאלה.
2. סיליות לא תנועתיות ב־Crown cells פועלות כאנטנות.
3. בצד שמאל נוצר אות תוך־תאי שמעלה את רמת הסידן.
4. אות הסידן מקדם ביטוי א-סימטרי של Nodal בצד שמאל.

מנוע Lrd

Lrd - Left-right dynein. Part of the outer dynein arm.

Lrd הוא dynein motor שמאפשר את תנועת הסיליות ב־Pit cells (חלק מהקומפלקס Outer dynein arm). מוטציות ב־Lrd מונעות תנועת סיליות, ולכן אין Nodal Flow. במוטנטים כאלה מתקבלים פנוטיפים של laterality defects.

עליית סידן בצד שמאל של ה־Node

מדידת סידן בעזרת אינדיקטור Fluo3 מראה אות חזק יותר בצד שמאל של ה־Node (של ה־Crown cells). ה־Fluo3 זוהר כאשר הוא קושר $\ce{Ca²⁺}$, ולכן עוצמת הפלואורסנציה משקפת עלייה בסידן התוך־תאי.

בתמונה: פלואורסנציה חזרה מסומנת באדום, וחלשה בירוק.

סידן לא שוהה חופשי בציטופלזמה. העלייה בסידן מצביעה על פתיחה של תעלות, או שחרור ממאגרים תוך־תאיים בצד שמאל. בשיעור קישרנו זאת לתעלות ממשפחת פוליציסטין (Polycystin).

תעלות פוליציסטין ו־PKD2

תעלות פוליציסטין הן תעלות יונים הקשורות ל־Calcium signaling. הן התגלו בין היתר בהקשר של מחלת כליה פוליציסטית (Polycystic Kidney Disease (PKD)).

בשיעור הודגשו שתי קבוצות:

• ביחס לכליה, קומפלקס נפוץ הוא PKD1/PKD2 (בתמונה השמאלית, שחסרים בה שני חלבונים נוספים מהקבוצה של PC2).
• ביחס לציר ימין-שמאל בעכבר, הקומפלקס שנדון הוא PKD1L1/PKD2.

PKD2 knockout

ב־PKD2 knockout מתקבלים laterality defects:

• Levocardia - מצב שבו הקודקוד עדיין פונה שמאלה.
• Mesocardia - מיקום אמצעי של הלב.
• Dextrocardia - קודקוד הלב פונה ימינה.
• Right lung isomerism - מאפיינים ימניים בשתי הריאות.
• אובדן ביטוי של Nodal/Lefty2 בצד שמאל, תוך שמירה יחסית של הביטוי סביב ה־Node.

רצף האירועים המרכזי

1. ה־heart tube הראשוני נוצר במרכז העובר והוא סימטרי.
2. בהתפתחות תקינה הוא עובר rightward looping.
3. סביב ה־Node מתחיל ביטוי של Nodal; בהמשך הביטוי נעשה חזק יותר בצד שמאל.
4. Nodal מופיע ב־left LPM ומפעיל תוכנית שמאלית הכוללת Lefty2 ו־Pitx2.
5. Lefty1 ב־midline יוצר מחסום שמפריד בין צד שמאל לצד ימין.
6. Nodal loss of function מוביל לרנדומיזציה של מיקום איברים ול־right isomerism.
7. Lefty loss of function מאפשר לתוכנית השמאלית להתפשט ויכול להוביל ל־left isomerism.
8. סיליות תנועתיות ב־Pit cells של ה־Node יוצרות Nodal Flow שמאלה.
9. Crown cells קולטים את הזרם דרך סיליות לא תנועתיות.
10. בצד שמאל עולה רמת $\ce{Ca²⁺}$, ובהמשך מופעל הביטוי הא-סימטרי של Nodal.
11. תעלות PKD2/PKD1L1 משתתפות בהמרת הזרם לאות תוך־תאי בצד שמאל.