מושגי יסוד בקישור ליגנדים
Ligands bind protein on a wide range of $K_{d}$ values.
הגדרות בסיסיות
- $\text{K}_{d}$ (קבוע דיסוציאציה) - ערך ללא יחידות שמבטא יחס, נותן מדד לאפיניות
- $\text{Y}$ - מספר האתרים התפוסים חלקי סך כל האתרים הקיימים
- אינטראקציה חזקה - High Affinity - $\text{K}_{d}$ מספר מאוד קטן ($10^{-16}$). כלומר, כמעט כל הליגנדים קשורים לחלבון.
- אינטראקציה חלשה - Low Affinity - $\text{K}_{d}$ מספר יחסית גדול ($10^{-2}$)
משוואת הקישור
משוואת הקישור הבסיסית:
\[\text{Y} = \frac{\left[\text{L}\right]}{\left[\text{L}\right] + \text{K}_{d}}\]כאשר:
- $\text{Y}$ = חלק האתרים התפוסים
- $\left[\text{L}\right]$ = ריכוז הליגנד
- $\text{K}_{d}$ = קבוע הדיסוציאציה
הפונקציה היא היפרבולית עם רוויה - ככל שמעלים את ריכוז הליגנד מגיעים לרוויה.
מדוע לא מגיעים ל-100% תפוסה?
הקישור הוא בשיווי משקל (לא קישור קוולנטי): התהליך הולך לשני הכיוונים כל הזמן, לכן לא יכול להיות מצב של 100% תפוסה. במצבים קיצוניים, נדרשים ריכוזי ליגנד כה גבוהים שרוב הליגנדים אינם מסיסים.
מיוגלובין
מבנה
- חלבון בודד של 16 קילודלטון (שרשרת אחת)
- מכיל טבעת הם (Heme) במרכזו
- שני היסטידינים חשובים:
- היסטידין 93 - היסטידין פרוקסימלי
- היסטידין 64 - היסטידין דיסטלי
- החמצן נקשר בין ההיסטידין הדיסטלי לברזל ($\ce{Fe^{2+}}$) במרכז טבעת ה-Heme. הקישור מושך את הברזל לכיוון הדיסטלי, נוצר מבנה מישורי.
תפקיד החלבון
למה צריך את החלבון ולא רק טבעת Heme חופשית?
הגנה מפני $\ce{CO}$:
- $\ce{CO}$ נקשר ל-Heme חופשי פי 20,000 יותר חזק מחמצן ($\ce{O2}$)
- אבל בתוך החלבון, $\ce{CO}$ נקשר רק פי 40 יותר חזק מחמצן
- זה מאפשר לנו לחיות בסביבה עם כמויות קטנות של $\ce{CO}$ (כמו גזי פליטה)
מייצר הגנה על ה-Heme שלא יתחמצן מדברים שאינם חמצן.
גרף קישור
בצד שמאל גרף תיאורטי, בצד ימין המדידה בפועל.
מיוגלובין מציג גרף קישור היפרבולי קלאסי - בדיוק כמו שהתיאוריה מנבאת.
$p_{50}$ - הלחץ החלקי של חמצן שבו 50% מהאתרים תפוסים (שווה ל-$K_{d}$).
תפקיד ביולוגי
- אחסון חמצן בשרירים
- לא מעביר חמצן בכל הגוף, רק במיקרו-סביבה
- משחרר חמצן בתנאים ספציפיים (pH וכו’)
המוגלובין
מבנה המוגלובין
- טטרמר - 4 תת-יחידות
- 2 שרשראות α (α1, α2)
- 2 שרשראות β (β1, β2)
- כל שרשרת מכילה טבעת Heme
- הרצפים של α זהים זה לזה, וכך גם של β
- אבל רצף α שונה מרצף β
שימור אבולוציוני
- ההיסטידינים שקושרים את ה-Heme שמורים בין כל השרשראות
- יש הבדלים ברצף (למשל, חסרים 5 Residues באזור מסוים ב-α)
- ההבדלים חשובים לתפקוד
צריך את השונות המבנית בשביל הפונקציה שהמוגלובין מתפקד.
שני מצבי קונפורמציה
T-State (Tense)
- דאוקסי-המוגלובין (ללא חמצן)
- Low affinity state
- הברזל נמשך מתחת למישור טבעת ה-Heme
R-State (Relaxed)
- אוקסי-המוגלובין (עם חמצן)
- High affinity state
- הברזל במישור טבעת ה-Heme
מנגנון השינוי הקונפורמטיבי
- חמצן נקשר לברזל
- האלקטרושליליות של החמצן מושכת את הברזל למעלה (לכיוון ההיסטידין הדיסטלי)
- הברזל מושך איתו את ההיסטידין הפרוקסימלי
- ההיסטידין מחובר לאלפא-הליקס ומושך אותו
- נוצר שינוי קונפורמטיבי בכל החלבון
אפקט אלוסטרי וקואופרטיביות
אפקט אלוסטרי
- אלוס = אחר, סטרי = צורה
- שינוי צורה ממקום אחר
- קישור באתר אחד גורם לשינוי קונפורמציה באתרים אחרים
- נפוץ באנזימים עם שרשראות רגולטוריות וקטליטיות
קואופרטיביות חיובית
- קישור הליגנד הראשון מעלה את האפיניות לליגנד השני
- התת-יחידה השנייה ״מוכנה״ יותר לקבל ליגנד
- יוצר עקומת קישור סיגמואידית (בצורת S)
קישור של משהו שמעלה את האפיניות של תת יחידה שכנה - קואופרטיביות.
החשיבות הביולוגית
- בריאות: לחץ חמצן $\sim 13-14 \, \mathrm{kPa}$
- ברקמות: לחץ חמצן $\sim 4 \, \mathrm{kPa}$
למה?
- אם ההמוגלובין היה תקוע ב-T-State: לא היה קושר מספיק חמצן בריאות
- אם היה תקוע ב-R-State: לא היה משחרר חמצן ברקמות
- הקואופרטיביות מאפשרת מעבר יעיל בין קישור בריאות לשחרור ברקמות
מודלים למעבר בין מצבים
שני מודלים מרכזיים
- מודל MWC (Monod-Wyman-Changeux) - “All or None”
- כל הטטרמר עובר בבת אחת מ-T ל-R
- מודל Sequential
- המעבר הדרגתי: תת-יחידה אחת משתנה, משפיעה על השכנה, וכן הלאה
הערה: ייתכנו מודלי ביניים (למשל α+β משתנות יחד, ואז הזוג השני)
שאלות ותשובות מההרצאה
ש: למי יש אפיניות גבוהה יותר - חלבון עם $p_{50}$ נמוך או גבוה?
ת: חלבון עם $p_{50}$ נמוך (יותר שמאלה בגרף) = אפיניות גבוהה יותר. במקרה הזה ל-$\text{A}$ יש אפיניות גבוהה יותר. צריך לבדוק מי מגיע מוקדם יותר ל-50% תפוסה ($p50$).
ש: מה ההבדל בין K association ל-K dissociation?
ת: אלה מדדים קינטיים (כמה מהר נקשר/עוזב), אבל בהרצאה התמקדנו בשיווי משקל
ש: האם המעבר מ-T ל-R הוא transition אחד או כמה?
ת: תלוי במודל - יכול להיות אחד (MWC) או הדרגתי (Sequential)
דור פסקל