שיעור 4 וירולוגיה מחזור החיים של וירוסים

תוכן העניינים:

1. הובלה בציטופלזמה וכניסה לגרעין
2. עקרונות יסוד לכל הווירוסים
3. ביטוי גנים מדורג - Cascade
4. מחזור ליטי ולטנטי
5. וירוסי DNA - מנגנונים ספציפיים
6. RNA Polymerases תאיים - איזה וירוסים משתמשים במה
7. פרומוטורים ואנהנסרים
8. פרומוטורים ואנהנסרים
9. סיכום: אסטרטגיות מיקום

הובלה בציטופלזמה וכניסה לגרעין

הציטופלזמה צפופה מאוד, ודיפוזיה פסיבית לבדה לא מספיקה לווירוס שצריך להגיע ליעדו. הפתרון: הווירוסים “תופסים טרמפ” על מערכת המיקרוטובולים התאית. חלבונים מוטוריים כמו Dynein ו-Kinesin צועדים לאורך המיקרוטובולים תוך פירוק ATP.

• Herpesvirus עובר fusion עם ממברנת התא והקפסיד עצמו מועבר לאורך המיקרוטובולים.
• Adenovirus לעומתו נכנס בתהליך אנדוציטוזה - הקפסיד ארוז בוסיקולת אנדוזום, ירידת ה-pH גורמת לשינוי קונפורמציה בחלבונים ולשחרור הקפסיד לציטופלזמה.

לאחר מכן, הווירוס צריך לחצות את הממברנה הגרעינית דרך ה-NPC (Nuclear Pore Complex). הכלל הבסיסי: חלבון לא יכול “להחליט” להיכנס לגרעין - הוא חייב לשאת Nuclear Localization Signal (NLS) שמזוהה על ידי חלבוני ייבוא, שמובילים אותו דרך ה-NPC.

וירוסים שונים פיתחו אסטרטגיות שונות כדי לעקוף את המגבלה הזו:

• Influenza - גנום RNA מפולח; כל סגמנט ארוז עם חלבון בעל NLS ונכנס לגרעין בנפרד
• Adenovirus - הקפסיד נפתח מחוץ ל-NPC; חלבון טרמינלי עם NLS מוביל את הגנום פנימה
• Herpesvirus - הקפסיד עוגן ב-NPC אך לא נכנס. ה-DNA ארוז בלחץ פנימי אדיר של כ-20 אטמוספירות (שווה ערך לכ-190 מטר מתחת לפני הים). ה-Portal נפתח וה-DNA מוזרק לגרעין בלחץ - בדיוק כמו בקטריופאג’ים
• וירוסים קטנים - קטנים מספיק לעבור ב-NPC בשלמותם

עקרונות יסוד לכל הווירוסים

וירוסים הם טפילים תוך-תאיים אובליגטוריים - הם תלויים לחלוטין בריבוזומים של התא המאכסן לייצור חלבונים. לכן המטרה המרכזית של כל וירוס היא לייצר mRNA שהמערכת התאית מכירה ויכולה לתרגם. סינתזת ה-RNA ושכפול הגנום יכולים להתבצע על ידי אנזימים ויראליים או תאיים, תלוי בוירוס.

מיקום הגנום נגזר מהלוגיקה: וירוסי DNA צריכים את RNA Pol II התאי שנמצא בגרעין, לכן הם בדרך כלל בגרעין. וירוסי RNA רוצים להיות קרוב לריבוזומים בציטופלזמה.

חריגים חשובים:

• Poxvirus (DNA בציטופלזמה - מביא מנגנון משלו)
• Hepadnavirus (גנום בגרעין, שכפול בציטופלזמה)
• Influenza ו-Retrovirus (RNA בגרעין).

לגבי RNA Polymerases תאיים: רוב הווירוסים משתמשים ב-RNA Pol II לייצור mRNA. RNA Pol III משמש חלק מהווירוסים לייצור RNA פונקציונלי קצר ומדויק. אין כרגע דוגמאות לווירוס המשתמש ב-RNA Pol I.

ביטוי גנים מדורג - Cascade

אחד העקרונות החשובים ביותר בווירולוגיה: הגנים הנגיפיים לא מתבטאים כולם בבת אחת, אלא בקסקדה מבוקרת.

• Immediate Early - הגנים הראשונים, מתבטאים תוך דקות מההדבקה. תוצריהם הם בדרך כלל Transcription Factors שמפעילים את השלב הבא. אינם תלויים בחלבונים ויראליים חדשים - המערכת התאית מספיקה, ולעיתים החלבון כבר מגיע עם הוויריון עצמו (כמו VP16 ב-HSV).

• Early - מקודדים בעיקר לחלבוני שכפול: DNA Polymerase, אנזימים נלווים. תלויים ב-Immediate Early, אך אינם תלויים בשכפול הגנום.

• Late - חלבוני קפסיד וחלבונים מבניים. מתבטאים רק לאחר שכפול הגנום - ומסיבות טובות: אין טעם לייצר קפסידים ריקים לפני שיש גנומים לארוז, וחלבוני קפסיד נוצרים בכמויות עצומות ורעילים לתא, לכן עדיף לייצרם רק לקראת סוף ההדבקה.

Immediate Early → Early → שכפול הגנום → Late

למה Late רק אחרי שכפול?

1. אין טעם לייצר קפסידים ריקים לפני שיש גנומים לארוז
2. חלבוני Late נוצרים בכמויות עצומות ורעילים לתא - עדיף לייצרם רק לקראת סוף ההדבקה

כיצד מזהים בניסוי מה שייך לאיזה שלב:

• מוסיפים מעכב סינתזת חלבון - אם עדיין מתבטא, זה Immediate Early.
• מוסיפים מעכב שכפול הגנום - אם עדיין מתבטא, זה Early; אם לא מתבטא, זה Late.

מחזור ליטי ולטנטי

כשוירוס כמו Herpesvirus מגיע לתא מטרה, הוא יכול לבחור באחת משתי אסטרטגיות:

• Lytic cycle: שכפול מסיבי, ייצור ויריונים, פיצוץ התא.
• Latency: הגנום נשמר בתא (כפלסמיד מעגלי/אפיזום, או לאחר אינטגרציה לגנום המאכסן), ביטוי מינימלי שרק שומר על הגנום ומונע זיהוי חיסוני.
  • בעת סטרס - Reactivation ומעבר חזרה לליטי.

ההחלטה תלויה גם בסוג התא: אותו וירוס יכול להיות ליטי בתא אחד ולטנטי בתא אחר.

reactivation מתרחש בעת סטרס (UV, חום, מחלה) - הווירוס עובר מלטנסי חזרה לליטי.

בקטריופאג’ λ - מודל קלאסי

שני חלבוני מפתח קובעים אם הווירוס ייבחר בלטנסי או בליטי: cI ו-Cro.

cI (Lambda Repressor) מדכא גנים ליטיים ומחזק את הביטוי של עצמו בלולאת משוב חיובי - כל עוד הוא קיים, הווירוס נשאר בלטנסי. אך הוא רגיש לסטרס: פרוטאז תאי חותך ומפרק אותו. ברגע שcI נעלם, Cro מצטבר, מעכב את cI ומפעיל את הגנים הליטיים.

מנגנון מעניין נוסף: תקשורת בין תאים (Arbitrium). בפאזה הליטית נוצר חלבון קטן שמופרש לסביבה. כשריכוזו גבוה - כלומר הרבה חיידקים כבר מודבקים - הוא מעודד כניסה ללטנסי בתאים חדשים. כך הווירוס לא “הורג” את כל המאכסנים הפוטנציאליים שלו.

כל עוד cI גובר ← לטנסי. ברגע שנעלם ← Cro משתלט ← ליטי.

• תקשורת בין תאים (Arbitrium): בפאזה הליטית נוצר חלבון קטן שמופרש לסביבה. כשריכוזו גבוה (= הרבה תאים כבר נדבקו), הוא מעכב מעבר לליטי בתאים חדשים - מנגנון שמונע מהווירוס להרוג את כל המאכסנים הפוטנציאליים.

• Superinfection Immunity: וירוס בלטנסי מונע כניסת וירוסים נוספים מאותו סוג (מעכב אנזימים המפרקים פפטידוגליקן, ומונע כניסת DNA ויראלי) - לא צריך לזכור פרטים, רק את הרעיון.

וירוסי DNA - מנגנונים ספציפיים

SV40

גנום דו-גדילי מעגלי ($\sim 5,000 \, \mathrm{bp}$), ארוז בנוקלאוזומים גם בתוך הוויריון עצמו. Large T-Antigen (תוצר Early) חוזר לגרעין ומגייס את מערכת הרפליקציה התאית לשכפל את הגנום הנגיפי.

מנגנון הבקרה על Late genes מעניין (“דילול הרפרסור”):

חלבון תאי (IBP) נמצא ברמה קבועה בתא ומדכא את ה-Late Promoter.

• בתחילת ההדבקה: יש מעט גנומים ויראליים - IBP מספיק לדכא הכל.
• לאחר שכפול: מספר הגנומים עולה בגדול אך כמות ה-IBP נשארת קבועה - הוא לא מספיק לדכא את כולם, וה-Late genes מתחילים להתבטא.

Adenovirus

גנום דו-גדילי ליניארי ($\sim 36,000 \, \mathrm{bp}$). חלבון ה-Immediate Early, E1A, הוא הדמות המרכזית כאן. הוא פועל על ידי קישור ל-Rb (Retinoblastoma protein).

במצב תקין, Rb קושר ומעכב את E2F (Transcription factor), ומונע מהתא להיכנס לשלב S-phase (השלב שבו מתרחשת סינתזת DNA).

כשE1A קושר את Rb, E2F משתחרר ופעיל - מה שגורם לביטוי גנים ויראליים וגם דוחף את התא ל-S-phase, שם, יש שפע נוקלאוטידים לשכפול הווירוס.

הקשר לסרטן: Papillomavirus (E7) עושה אותו דבר בדיוק לRb. Rb הוא Tumor Suppressor קלאסי, ומוטציות בו גורמות לסרטן. יש אפילו אותו רצף שמור (conserved) שמזהה את Rb בוירוסים שונים - עדות לאבולוציה מתכנסת.

גילוי היסטורי חשוב: ה-splicing התגלה ב-Adenovirus. כשהיברידיזציה בין ה-DNA ל-mRNA גילתה loops גדולים - הוכחה שלא כל רצף ה-DNA מיוצג ב-mRNA הבשל.

HSV-1 (Herpes Simplex Virus)

VP16 מגיע עם הוויריון (חלבון Tegument) ויוצר קומפלקס עם שני חלבונים תאיים - Oct-1 ו-HCF - הופך אותם לאקטיבטורי שעתוק חזקים ומפעיל את Immediate Early genes (ICP4, ICP0). הקפסידים גדולים מדי ל-NPC, ולכן הם יוצאים בתהליך של ממש קריעת ממברנת הגרעין - Nuclear Egress.

מדוע לטנסי בנוירונים? הכל תלוי ב-HCF. בתאי אפיתל, HCF נמצא בגרעין ← קומפלקס VP16+Oct-1+HCF נוצר ← Lytic cycle. בנוירונים, HCF נמצא בציטופלזמה ← הקומפלקס לא נוצר ← Latency. בלטנסי, הגנום ארוז ב-repressive chromatin. בעת סטרס, פוספורילציה של היסטונים פותחת את הכרומטין ← reactivation.

קלינית: זה מסביר את פצעי השפתיים החוזרים. הווירוס נדבק לתאי אפיתל (ליטי) ← עובר לנוירוני הגנגליון (לטנסי) ← UV/חום/סטרס ← reactivation ← נדידה חזרה לשפתיים ← פצעים. חוזר ונשנה לכל החיים.

מחזור ליטי:

• הקפסיד נכנס עם חלבוני Tegument (שכבה בין קפסיד לממברנה)
• VP16 (חלבון Tegument שמגיע עם הוויריון) ← יוצר קומפלקס עם Oct-1 + HCF ← מפעיל Immediate Early genes (ICP4, ICP0)
• קפסידים גדולים מדי ל-NPC ← Nuclear Egress: קריעת הממברנה הגרעינית

מדוע לטנסי בנוירונים?

	תאי אפיתל	נוירונים
מיקום HCF	גרעין	ציטופלזמה
VP16 + Oct-1 + HCF	קומפלקס נוצר בגרעין	HCF לא בגרעין ← קומפלקס לא נוצר
תוצאה	Lytic cycle	Latency

בלטנסי: הגנום ארוז ב-repressive chromatin. בעת סטרס: פוספורילציה של היסטונים ← chromatin נפתח ← reactivation.

קלינית: HSV-1 ← פצעי שפתיים. וירוס נשאר רדום בגנגליון ← UV/חום/סטרס ← reactivation ← נדידה חזרה לשפתיים ← פצעים חוזרים לכל החיים.

Poxvirus (Vaccinia) - חריג קיצוני

למרות שהוא וירוס DNA, משכפל בציטופלזמה בלבד ומביא את כל מנגנון השעתוק שלו:

• Viral RNA polymerase (דומה לפולימרזות אוקריוטיות)
• mRNA capping enzyme
• Poly(A) polymerase
• Methyltransferases

לאחר כניסה לתא, הקפסיד נפתח חלקית, mRNA יוצא ועובר תרגום, והחלבונים שנוצרים ממשיכים את מחזור ההדבקה. נקודה חשובה: הוא עדיין צריך נוקלאוטידים מהתא - אותם הוא לא מביא.

AAV (Adeno-Associated Virus) ssDNA

גנום חד-גדילי (ssDNA) בוויריון. לאחר כניסה, המערכת התאית משלימה ל-dsDNA. אינו יכול לשכפל ביעילות לבד ודורש helper virus (Adenovirus או HSV) - ומכאן שמו, שכן תמיד גילו אותו ביחד עם Adenovirus. כיום כלי מרכזי ב-gene therapy בשל בטיחותו היחסית.

RNA Polymerases תאיים - איזה וירוסים משתמשים במה

פרומוטורים ואנהנסרים

Promoter ממוקם בדיוק לפני הגן - מיקומו וכיוונו קריטיים. מכיל לעיתים TATA box הנקשר על ידי TBP (TATA Binding Protein); כ-50% מהפרומוטורים התאיים מכילים TATA box.

Enhancer שונה מהותית: הוא יכול לפעול ממרחקים עצומים (מאות אלפי $\mathrm{bp}$), מ-upstream או downstream לפרומוטור, ואפילו בכיוון הפוך - לכן הוא מוגדר כ-position and orientation independent.

המנגנון הוא DNA looping - לולאה פיזית ב-DNA מקרבת את האנהנסר לפרומוטור. מסתבר שאנהנסרים גם מייצרים RNA קצר שאינו מקודד לחלבון (eRNA), שמסייע לחיבור הפיזי הזה.

פרומוטורים ואנהנסרים

KSHV כדוגמה מחקרית עכשווית: נמצאו 6 אנהנסרים בגנום - 2 קונסטיטוטיביים/לטנטיים, 1 ספציפי לתאי אנדותל, ו-4 ליטיים בלבד. הפעלת אנהנסר ליטי יכולה לדחוף את הווירוס לליטי סייקל, ועיכובו - אולי לעכבו.

גילויים היסטוריים דרך וירוסים:

• Splicing - גילוי ב-Adenovirus (loops בהיברידיזציה DNA-mRNA)
• Enhancers - האנהנסר הראשון גולה ב-SV40 (שני רצפים של 72 bp ← פי 100 ביטוי)
• General Transcription Factors (GTFs) - זוהו דרך ניסויי in vitro עם פרומוטורים ויראליים (HIV LTR, Adenovirus Major Late Promoter) - ניסוי G-less cassette

לשיעורים הבאים: Retrovirus, RNA viruses, Hepadnavirus

סיכום: אסטרטגיות מיקום