שיעור 4 וירולוגיה מחזור החיים של וירוסים

כניסה לתא ומעבר בציטופלזמה

ניווט תוך-תאי

• הציטופלזמה היא סביבה צפופה מאוד
• דיפוזיה לבדה אינה יעילה למעבר וירוסים
• וירוסים משתמשים במערכות תעבורה תאיות:
  • מיקרוטובולים (Microtubules)
  • מנגנוני תנועה על גבי הציטושלד

דוגמאות למנגנוני כניסה

Herpes Virus

• עובר fusion עם ממברנת התא
• הקפסיד נקשר לחלבונים מוטוריים
• מועבר לאורך המיקרוטובולים לכיוון הגרעין

Adenovirus

• תהליך אנדוציטוזיס (Endocytosis)
• כל הוזיקולה של האנדוזום מועברת לתוך הציטופלזמה
• הוירוס יוצא מהוזיקולה ומתחיל במחזור החיים

מעבר לגרעין התא

Nuclear Pore Complex (NPC)

• חלבונים דורשים Nuclear Localization Signal (NLS) ספציפי
• ה-NLS נקשר לחלבונים מעבירים המובילים אל הגרעין

אסטרטגיות שונות של וירוסים

Influenza Virus

• גנום RNA מפולח (segmented)
• כל סגמנט עטוף בחלבון עם NLS
• כל הסגמנטים נכנסים לגרעין בנפרד

Herpes Simplex Virus (HSV)

• הגנום ארוז בקפסיד בלחץ של ~20 אטמוספירות (equivalent to 190m underwater pressure)
• הקפסיד מגיע ל-NPC
• רק הפורטל נפתח
• ה-DNA מוזרק לגרעין בלחץ

Adenovirus

• הקפסיד נפתח מחוץ לגרעין
• פורטל חלבון עם NLS
• מכניס את הגנום פנימה

וירוסים קטנים

• עוברים דרך ה-NPC או הממברנה הגרעינית ישירות

סינתזה של חלבונים ושכפול

עקרונות יסוד

1. ייצור תבנית RNA
   • חייבת להיות ניתנת לתרגום על ידי ריבוזומים תאיים
   • סינתזת ה-RNA יכולה להתבצע:
     • על ידי אנזים ויראלי
     • או באמצעות אנזים תאי
2. שכפול הגנום הויראלי
   • יכול להתבצע באמצעות חלבון תאי או ויראלי
3. חלבוני בקרה
   • משנים סיגנלים תאיים
   • משנים את התא מתאובה להדבקה
   • אנזימים המסייעים בסינתזת הגנום
4. ביטוי מדורג
   • חלבונים מיוצרים בשלבים שונים:
     • Immediate Early - מיד לאחר הדבקה
     • Early - חלבוני רפליקציה
     • Late - חלבונים מבניים (קפסיד)

מיקום הגנום בתא

DNA Viruses

• בדרך כלל בגרעין (משתמשים במערכת השעתוק התאית)
• חריגות:
  • Poxvirus (כמו Vaccinia) - בציטופלזמה, מביא את כל האנזימים שלו
  • Hepadnavirus - הגנום בגרעין אך הרפליקציה בציטופלזמה

RNA Viruses

• בדרך כלל בציטופלזמה (הריבוזומים נמצאים שם)
• חריגות:
  • Retrovirus
  • Orthomyxovirus (Influenza) - גנום RNA אך נמצא בגרעין

Lytic vs. Latency Cycles

Herpes Virus - שני מסלולים

Lytic Cycle (מחזור ליטי)

• הגנום הליניארי הופך למעגלי בגרעין
• ייצור מסיבי של חלבונים
• יצירת ויריונים חדשים
• התפוצצות התא ושחרור

Latency (חביון)

• הגנום נשמר בתא מארח
• ביטוי מינימלי של חלבונים
• הימנעות מזיהוי חיסוני
• יכול להימשך שנים

מנגנון ההחלטה - דוגמה בבקטריופאג’ λ

חלבוני בקרה מרכזיים

CI (Lambda Repressor)

• מדכא ביטוי של גנים ליטיים
• מפעיל ביטוי של עצמו (positive feedback)
• רגיש לסטרס - מתפרק בנוכחות פרוטאז תאי

Cro Protein

• מעכב ביטוי של CI
• מפעיל את הגנים הליטיים

Superinfection Immunity

• פאג’ בלטנסי מונע כניסת פאג’ים נוספים:
  • עיכוב אנזימים המפרקים פפטידוגליקן
  • מניעת כניסת DNA ויראלי

Communication Between Cells

• בפאזה ליטית: ייצור חלבון Arbitrium
• Arbitrium מופרש ונקלט על ידי חיידקים אחרים
• ריכוז גבוה של Arbitrium → כניסה ללטנסי (מניעת הרג כל התאים)

DNA Viruses - מנגנונים מולקולריים

Baltimore Classification

• מבוסס על אופן ייצור mRNA לתרגום

DNA Viruses - גנום כפול

מאפיינים כלליים

• גנום יציב
• גודל: אלפי עד מאות אלפי base pairs
• שכפול ושעתוק דומים למערכת התאית
• בדרך כלל בגרעין
• שיעור טעויות נמוך (בניגוד ל-RNA viruses)
• ביטוי מדורג

RNA Polymerases תאיים

RNA Pol I

• מייצר rRNA (ribosomal RNA)
• tRNA, 5.8S, 18S, 28S
• אין דוגמאות לשימוש ויראלי

RNA Pol II (השימוש הנפוץ ביותר)

• מייצר mRNA
• microRNA
• long non-coding RNA
• לא מדויק בנקודות התחלה וסיום מדויקות

RNA Pol III

• מייצר RNA קצר ומדויק
• tRNA
• 5S rRNA
• חלק מהוירוסים משתמשים לייצור RNA פונקציונלי

SV40 (Simian Virus 40)

מבנה הגנום

• גנום דו-גדילי מעגלי (~5,000 bp)
• ארוז בנוקלאוזומים (גם בתוך הוויריון)

ביטוי מדורג

Early Genes

• Large T-Antigen (LT)
• Small T-Antigen (ST)
• מתבטאים באמצעות מערכת התאית
• LT חוזר לגרעין ומגייס מערכת הרפליקציה התאית

Late Genes

• חלבוני קפסיד מבניים
• מתבטאים רק לאחר רפליקציה של הגנום

מנגנון בקרה

• חלבון תאי: Initiator Binding Protein (IBP)
• ברמה קבועה בתא
• נקשר לאזור רגולטורי ויראלי (3 binding sites)
• כשיש מעט עותקי גנום → רפרסיה של Late Promoter
• לאחר רפליקציה: יותר גנומים מאשר IBP → ביטוי Late Genes

Adenovirus

מבנה הגנום

• דו-גדילי ליניארי (~36,000 bp)
• הקפסיד מתפרק מחוץ ל-NPC
• ה-DNA נכנס לגרעין

שלבי ביטוי

Immediate Early: E1A

• Transcription factor
• מפעיל Early Genes
• גורם לרכרום כרומטין

Early Genes

• חלבוני DNA polymerase
• חלבוני רפליקציה
• אנזימים נלווים

Late Genes

• חלבונים מבניים
• הרכבת קפסידים

גילוי Splicing

• Adenovirus היה הראשון בו התגלה splicing
• היברידיזציה של DNA עם mRNA גילתה loops גדולים
• ביטוי מורכב עם alternative splicing

Adenovirus E1A - מנגנון מולקולרי

אינטראקציה עם Retinoblastoma (Rb)

מצב תקין בתא:

• $\text{Rb}$ קושר ומעכב $\text{E2F}$ (transcription factor)
• כדי להיכנס ל-S-phase: פוספורילציה של Rb → שחרור E2F

אסטרטגיה ויראלית:

E1A → binds Rb → releases E2F → S-phase genes transcription

• E1A קושר את Rb
• E2F משוחרר ופעיל
• מפעיל גם גנים ויראליים וגם דוחף את התא ל-S-phase
• S-phase מספק נוקלאוטידים לרפליקציה ויראלית

קשר לסרטן

• Papillomavirus: E6 ו-E7 מעכבים Rb באופן דומה
• רצף קונסרבטיבי בין וירוסים שונים
• Rb הוא tumor suppressor - מוטציות גורמות לסרטן

רגולציה של ביטוי גנים

Positive Feedback Loop

Gene X → RNA → Protein X
                 ↓
        Binds own promoter → Enhanced transcription

Cascade Regulation (מדורג)

Immediate Early Gene X → Protein X
                                                    ↓
                                        Activates Early Genes → Early Proteins
                                                                                            ↓
                                                                                 DNA Replication
                                                                                            ↓
                                                                                 Late Genes

פרומוטורים ואנהנסרים (Enhancers)

פרומוטור

• מיקום קבוע לפני הגן
• מכיל TATA box (רצף T-A-T-A)
• TBP (TATA Binding Protein) קושר אותו
• ~50% מהפרומוטורים התאיים מכילים TATA box

אנהנסר

הגדרה: רצף DNA המגביר transcription בצורה position and orientation independent

מאפיינים:

• יכול להיות upstream או downstream לפרומוטור
• יכול להיות במרחק של kb רבים
• פועל באמצעות DNA looping
• יכול לפעול בכיוון הפוך

מנגנון פעולה:

• קושרים transcription factors
• coactivators
• מייצר enhancer RNA (eRNA) - non-coding
• eRNA מסייע ביצירת הקשר עם הפרומוטור

מחקר KSHV (Kaposi’s Sarcoma Herpesvirus):

• זוהו 21 אזורי open chromatin בגנום
• נמצאו 6 enhancers:
  • 2 constitutive/latency enhancers
  • 1 tissue-specific (endothelial cells)
  • 4 lytic-specific enhancers

ניסוי Luciferase Reporter

Promoter → Luciferase gene
        ↑
Putative enhancer (downstream)

Measure: Light output = transcription activity

פרומוטורים ויראליים בהיסטוריה

• HIV LTR promoter
• Adenovirus Major Late Promoter
• שימשו לגילוי General Transcription Factors (GTFs)

ניסוי קלאסי:

• G-less cassette (ללא גואנין ברצף)
• עצירה בנוכחות G
• הוספה/הסרה של GTFs בודדים
• הוכחת הכרחיות: TFIIB, TFIID, וכו’

Herpes Simplex Virus (HSV-1)

מחזור ליטי

שלבים:

1. Fusion עם ממברנת התא
2. הקפסיד נכנס עם tegument proteins (שכבת חלבונים בין קפסיד לממברנה)
3. הגנום הליניארי נכנס לגרעין והופך למעגלי

Immediate Early: VP16

• חלבון tegument (נכנס עם הוויריון)
• Transcription activator
• לא קושר DNA ישירות
• יוצר קומפלקס עם חלבונים תאיים:
  • Oct-1
  • HCF (Host Cell Factor)
• מפעיל Immediate Early genes: ICP4, ICP0

Early Genes

• אנזימי רפליקציה
• DNA polymerase
• חלבוני עזר
• רפליקציה של הגנום הויראלי

Late Genes

• חלבוני קפסיד
• tegument proteins
• glycoproteins
• הרכבת ויריונים

Nuclear Egress

• קפסידים גדולים מדי ל-NPC
• קריעת הממברנה הגרעינית
• יציאה לציטופלזמה
• הוספת tegument וממברנה

Latency בנוירונים

מנגנון כניסה ללטנסי:

בתאי אפיתל:

• HCF נמצא בגרעין
• VP16 + Oct-1 + HCF → Lytic cycle

בנוירונים:

• HCF נמצא בציטופלזמה (לא בגרעין!)
• אין הפעלה של Immediate Early genes
• כניסה ללטנסי

שינויים אפיגנטיים בלטנסי:

• הגנום ארוז ב-repressive chromatin
• מודיפיקציות היסטונים מדכאות
• במצב סטרס: phosphorylation של היסטונים
• שינוי ל-open chromatin → reactivation

HSV-1 וזיהום קליני:

• הדבקה ראשונית: תאי אפיתל בשפתיים → lytic cycle
• מעבר לנוירונים → latency בגנגליון
• reactivation (UV, חום, סטרס) → נדידה חזרה לשפתיים → פצעים
• חוזר שוב ושוב לאורך החיים

זיהוי Early vs. Late Genes

שימוש במעכבים

Immediate Early:

• מתבטאים גם בנוכחות מעכבי סינתזת חלבון
• לא תלויים בחלבונים ויראליים
• בדרך כלל transcription factors

Early:

• דורשים חלבונים ויראליים (Immediate Early)
• אינם דורשים רפליקציה
• מתבטאים בנוכחות מעכבי רפליקציה

Late:

• תלויים ברפליקציה
• מעכב רפליקציה → אין ביטוי
• בדרך כלל חלבונים מבניים

Poxvirus (Vaccinia)

אסטרטגיה ייחודית

• DNA virus בציטופלזמה!
• לא משתמש במערכת השעתוק הגרעינית
• מביא את כל המנגנון שלו:

אנזימים ויראליים:

• Viral DNA-dependent RNA polymerase
• mRNA capping enzyme
• Poly(A) polymerase
• Methyltransferases

שלבים:

1. הקפסיד נשאר חלקית סגור
2. כניסת נוקלאוטידים ומולקולות קטנות
3. transcription בתוך הקפסיד
4. mRNA יוצא ועובר translation
5. חלבונים חוזרים ומפעילים שאר הגנים
6. רפליקציה
7. Late genes
8. הרכבת ויריונים

Single-Stranded DNA Viruses

Adeno-Associated Virus (AAV)

מבנה:

• גנום ssDNA בוויריון
• נכנס לתא → המערכת התאית משלימה ל-dsDNA
• מיניסרקל dsDNA בגרעין

תלות בוירוסים אחרים:

• שם: “Adeno-Associated” - התגלה תמיד עם Adenovirus
• לא יעיל ברפליקציה עצמאית
• דורש “helper virus”:
  • Adenovirus
  • Herpes Simplex Virus
• ה-helper מספק חלבונים לרפליקציה יעילה

שימוש בגנטיקה:

• כלי פופולרי ל-gene therapy
• בטוח יחסית
• יכולת אריזה מוגבלת

סיכום: DNA Viruses Strategy

עקרונות משותפים

1. Immediate Early genes
   • Transcription factors
   • לא תלויים בחלבונים ויראליים חדשים
   • דוגמאות: SV40 (Large T), Adenovirus (E1A), HSV (VP16)
2. Early genes
   • חלבוני רפליקציה
   • תלויים ב-Immediate Early
   • לפני רפליקציה של הגנום
3. DNA replication
   • נקודת מפנה במחזור
   • מאפשרת ביטוי Late genes
4. Late genes
   • חלבונים מבניים (קפסיד)
   • רק לאחר רפליקציה
   • ייצור מסיבי
   • לעיתים טוקסיים לתא

אסטרטגיות מיקום

בקרת ביטוי

• רמת פרומוטור: קישור של repressors/activators
• רמת אנהנסר: הגברה מרחוק
• כרומטין: מודיפיקציות היסטונים (במיוחד ב-latency)
• מלאי נוקלאוטידים: דחיפת התא ל-S-phase (E1A, LT)
• ריכוז גנומים: דילול של repressors תאיים

נושאים לשיעורים הבאים:

• Retrovirus (DNA virus עם שלב RNA)
• RNA viruses
• Partially dsDNA viruses

סיכום לשינון

1. כניסת הנגיף לתא המאכסן והובלה תוך-תאית

• הובלה בציטופלזמה: לאחר החדירה לתא, הנגיף אינו מסתמך על דיפוזיה פסיבית בציטופלזמה הצפופה. במקום זאת, נגיפים “תופסים טרמפ” על מערכות ההובלה של התא, בעיקר מערכת ה-Microtubules.
  • דוגמאות:
    • Herpesvirus: לאחר איחוי (Fusion) עם ממברנת התא, הקפסיד (Capsid) נקשר לחלבונים ומוּבָל לאורך ה-Microtubules לכיוון גרעין התא.
    • Adenovirus: נכנס בתהליך אנדוציטוזה (Endocytosis). הוסיקולה (Vesicle) כולה, המכילה את הנגיף, מובלת לאורך ה-Microtubules.
• כניסה לגרעין התא: נגיפים רבים צריכים להכניס את החומר הגנטי שלהם לגרעין. התהליך דורש מנגנונים מיוחדים להתגבר על הממברנה הכפולה של הגרעין.
  • Nuclear Localization Signal (NLS): רצף חומצות אמינו ספציפי המאפשר לחלבונים (או לקומפלקסים של חומר גנטי-חלבון) להיות מיובאים לתוך הגרעין דרך ה-Nuclear Pore Complex (NPC).
  • אסטרטגיות כניסה לגרעין:
    1. Influenza Virus: הגנום מסוג RNA מחולק לסגמנטים. כל סגמנט ארוז עם חלבונים המכילים NLS, המאפשרים את כניסתם לגרעין.
    2. Adenovirus: הקפסיד מתקרב ל-NPC ונפתח. חלבון טרמינלי הקשור לגנום ה-DNA הלינארי מכיל NLS ומוביל את הגנום כולו לתוך הגרעין.
    3. Herpesvirus: הקפסיד עוגן ב-NPC. בשל לחץ אוסמוטי אדיר (שווה ערך ל-20 אטמוספירות) בתוך הקפסיד, ה-DNA מוזרק ישירות לתוך הגרעין דרך חלבון שער (Portal Protein) ייעודי, ללא כניסת הקפסיד כולו.
    4. נגיפים קטנים: יכולים לעבור בשלמותם דרך ה-NPC.

2. שכפול הגנום וביטוי גנים ויראליים

עקרונות יסוד

• נגיפים הם טפילים תוך-תאיים אובליגטוריים, התלויים לחלוטין במנגנוני התא המאכסן (כגון ריבוזומים) לייצור חלבונים.
• המטרה המרכזית היא לייצר מולקולות mRNA שיוכלו להיות מתורגמות על ידי ריבוזומי התא.
• סינתזת RNA ושכפול הגנום יכולים להתבצע על ידי אנזימים ויראליים או תאיים.
• הגנום הנגיפי מקודד לחלבונים מבניים, אנזימים וחלבוני בקרה המשנים את סביבת התא לטובת הנגיף.

מיקום השכפול

• נגיפי DNA: לרוב משכפלים את עצמם בגרעין, כדי לנצל את מנגנוני השעתוק (כמו RNA \ Polymerase \ II) והשכפול של התא.
  • יוצאי דופן:
    • Poxviruses (כדוגמת Vaccinia): נגיפי DNA גדולים המשכפלים את עצמם בציטופלזמה. לשם כך, הם מביאים איתם את כל האנזימים הדרושים להם (פולימראזות, אנזימי Capping ו-Polyadenylation).
• נגיפי RNA: לרוב משכפלים את עצמם בציטופלזמה, בסמוך לריבוזומים המתרגמים את תוצריהם.
  • יוצאי דופן:
    • Orthomyxoviruses (כדוגמת Influenza): משכפלים בגרעין.
    • Retroviruses: משכפלים בגרעין.

3. מחזור ליטי (Lytic) ומחזור לטנטי (Latent)

נגיפים מסוימים יכולים לבחור בין שתי אסטרטגיות הדבקה:

• Lytic Cycle (המחזור הליטי): שכפול פעיל של הנגיף, ייצור מסיבי של ויריונים חדשים, ולבסוף הרס (Lysis) של התא המאכסן ושחרור הצאצאים.
• Latency (לטנטיות / חביון): הנגיף נשאר “רדום” בתא. הגנום הנגיפי נשמר (לעיתים תוך אינטגרציה לגנום המאכסן), אך ביטוי הגנים מופחת למינימום, מה שמאפשר לנגיף לחמוק ממערכת החיסון.
  • Reactivation (הפעלה מחדש): בתנאי עקה (Stress) מסוימים, הנגיף הלטנטי יכול לעבור הפעלה מחדש ולחזור למחזור הליטי.

דוגמאות ובקרה

א. בקטריופאג’ למדא ($\lambda$)

• לאחר הזרקת ה-DNA לחיידק, הגנום הופך למעגלי.
• Latency: הגנום עובר אינטגרציה לתוך כרומוזום החיידק באמצעות רקומבינציה.
• Lytic: הגנום משוכפל במנגנון “מעגל מתגלגל” (Rolling Circle Replication), נוצרים ויריונים חדשים והחיידק מפורק.
• ההחלטה בין המסלולים: נשלטת על ידי מאזן בין שני חלבוני מפתח:
  • cI (Repressor): רמה גבוהה שלו מדכאת את הגנים הליטיים ומקדמת לטנטיות.
  • Cro: רמה גבוהה שלו מדכאת את cI ומפעילה את הגנים הליטיים.
  • עקה סביבתית גורמת לפירוק cI ומעבר למסלול הליטי.

ב. Herpesvirus

• במחזור הליטי: הגנום הלינארי הופך למעגלי בגרעין, מתרחש ביטוי גנים מדורג, שכפול הגנום, הרכבת ויריונים ושחרורם.
• במחזור הלטנטי: הנגיף נשאר רדום בתאים מסוימים (למשל, נוירונים). ביטוי הגנים מינימלי.
• ההחלטה בין המסלולים: תלויה בסוג התא ובזמינות פקטורי שעתוק תאיים.
  • לדוגמה, החלבון הוויראלי VP16 חיוני להפעלת המחזור הליטי. בנוירונים, פקטור תאי חיוני לפעולת VP16 (החלבון HCF) נמצא בציטופלזמה ולא בגרעין, ולכן המחזור הליטי אינו מופעל והנגיף נכנס ללטנטיות.

4. ביטוי גנים מדורג בנגיפי DNA

ביטוי הגנים בנגיפים אלו מאורגן בקסקדה (Cascade) מבוקרת היטב:

1. Immediate Early (IE) Genes: הגנים הראשונים המתבטאים. תוצריהם הם לרוב פקטורי שעתוק המפעילים את השלב הבא. ביטויים אינו דורש סינתזת חלבונים ויראליים חדשים.
2. Early (E) Genes: מקודדים לחלבונים הדרושים לשכפול הגנום הוויראלי (למשל, DNA \ Polymerase) ולשינוי סביבת התא. ביטויים דורש את תוצרי גני ה-IE.
3. Late (L) Genes: מקודדים לחלבונים מבניים (כמו חלבוני הקפסיד). ביטויים מתרחש לאחר תחילת שכפול הגנום הוויראלי, כדי להבטיח שיש מספיק עותקי גנום לאריזה.

דוגמאות לבקרה

• SV40: חלבון ה-Large T-Antigen (תוצר Early) גורם לשכפול ה-DNA הוויראלי ומפעיל את ביטוי גני ה-Late.
• Adenovirus: חלבון ה-E1A (תוצר IE) מפעיל את גני ה-Early על ידי קישור וחסימת החלבון התאי Rb (Retinoblastoma), מה שמשחרר את פקטור השעתוק E2F ודוחף את התא לשלב S (סינתזת DNA).
• Herpesvirus (HSV-1): החלבון VP16 (מגיע עם הוויריון) מפעיל את גני ה-IE. תוצרי ה-IE מפעילים את גני ה-Early, ולאחר שכפול ה-DNA, מופעלים גני ה-Late.

5. בקרת שעתוק ו-Enhancers

• Promoter: רצף DNA הממוקם בסמוך לנקודת תחילת השעתוק, אליו נקשר RNA \ Polymerase. מיקומו וכיוונו קריטיים.
• Enhancer: רצף DNA שיכול להגביר משמעותית את רמת השעתוק מה-Promoter. בניגוד ל-Promoter, ה-Enhancer יכול לפעול ממרחק רב, ללא תלות במיקומו (upstream/downstream) או באוריינטציה שלו. הוא פועל באמצעות יצירת לולאה (Looping) ב-DNA המקרבת אותו פיזית ל-Promoter.
• גילויים:
  • Splicing: התהליך בו אינטרונים מוסרים מ-pre-mRNA, התגלה לראשונה במחקר על Adenovirus.
  • Enhancers: ה-Enhancer הראשון התגלה בנגיף SV40.
  • נגיפים רבים, כמו KSHV (סוג של Herpesvirus), משתמשים ב-Enhancers כדי לבקר את ביטוי הגנים שלהם באופן ספציפי לרקמה או לשלב במחזור החיים (ליטי/לטנטי).