שיעור 17 שעתוק באאוקריוטים ו-RNA Polymerase II

תוכן העניינים:

1. פתיחה - מחיידקים לאאוקריוטים
2. RNA Polymerase II
3. CTD - הזנב שמנהל את השעתוק
4. פרומוטורים של Pol II
5. General Transcription Factors ו־PIC
6. Mediator ואלמנטים רגולטוריים רחוקים
7. שלבי השעתוק של RNA Polymerase II
8. Promoter-proximal pausing
9. Elongation ועיבוד ה־RNA תוך כדי שעתוק
10. Termination ו־polyadenylation

פתיחה - מחיידקים לאאוקריוטים

בשיעור הקודם למדנו על שעתוק בחיידקים. בחיידקים יש RNA polymerase אחד, ובעזרת sigma factors שונים הוא מסוגל לשעתק סוגים שונים של RNA.

בתאים אאוקריוטיים המצב מורכב יותר. יש שלושה RNA polymerases מרכזיים:

השיעור מתמקד ב־RNA polymerase II, שהוא הפולימראז שאחראי בעיקר על יצירת mRNA.

RNA Polymerase II

RNA polymerase II הוא קומפלקס חלבוני גדול שמורכב מ־12 תת־יחידות.

עשר מתת־היחידות דומות לתת־יחידות שנמצאות גם ב־RNA polymerase I ו־RNA polymerase III. שתי תת־יחידות ייחודיות יותר ל־Pol II, והן יוצרות אזור שנקרא stalk. האזור הזה מאפשר קישור של חלבונים שונים שבאים באינטראקציה עם Pol II במהלך השעתוק.

RPB1 ו־RPB2

לתת־היחידות של Pol II קוראים RPB.

תת־היחידה הגדולה ביותר היא RPB1. היא כוללת:

• את האזור הקטליטי של הפולימראז.
• את ה־CTD, שהוא הזנב הייחודי של Pol II.

תת־היחידות RPB1 ו־RPB2 יוצרות את המבנה המרכזי של הפולימראז. ביניהן יש אזור שנקרא cleft - סדק שאליו נכנס ה־DNA.

ה־cleft טעון חיובית, ולכן הוא מתאים לקישור DNA, שהוא מולקולה טעונה שלילית.

מבנים חשובים בפולימראז

Pol II נראה ומתפקד קצת כמו “פאקמן” מולקולרי: ה־DNA נכנס לתוך הסדק, הפולימראז מחזיק אותו, פותח אותו, מסנתז RNA, ומשחרר את ה־RNA החדש החוצה.

מוטציה ב־clamp תפגע ביציבות הקומפלקס.

מרכיבים חשובים:

• Cleft - הסדק שאליו נכנס ה־DNA.
• Clamp - אזור ב־RPB1 שתופס את ה־DNA ושומר אותו במקום.
• Shelf - מכוון את ה־DNA לתוך הפולימראז.
• Bridge - משתתף במשיכת ה־DNA פנימה.
• Rudder ו־lid - שומרים על בועת השעתוק פתוחה ומסייעים בהפרדת RNA מה־DNA.
• Wall - גורם ל־DNA לקבל זווית, וכך מסייע ליציאת ה־RNA.
• RNA exit channel - האזור שממנו יוצא ה־RNA החדש.
• Pore - דרכו נכנסים הנוקלאוטידים הדרושים לסינתזת RNA.

Cleft של Pol II הוא אחד האזורים הכי שמורים באבולוציה. הוא תעלה בה ממוקם גדיל ה־Template ומתרחשת הסינתזה.

CTD - הזנב שמנהל את השעתוק

ל־RNA polymerase II יש זנב ייחודי שנקרא CTD - C-terminal domain.

ה־CTD הוא אזור ארוך ולא מקופל, שנמצא בקצה של RPB1. הוא ייחודי ל־Pol II, והוא חשוב כמעט לכל שלבי השעתוק.

מבנה ה־CTD

ה־CTD בנוי מחזרות של רצף בן שבע חומצות אמינו:

YSPTSPS

כלומר:

Tyrosine - Serine - Proline - Threonine - Serine - Proline - Serine

באדם יש 52 חזרות של הרצף הזה.

פוספורילציות על ה־CTD

חומצות האמינו ב־CTD יכולות לעבור פוספורילציה. הפוספורילציות האלה משתנות לאורך השעתוק, והן יוצרות מעין “קוד” שמאפשר קישור ושחרור של חלבונים שונים.

הפוספורילציות אינן מופיעות בבת אחת על כל החזרות. הן מופיעות כגרדיאנט שמשתנה לאורך הגן.

ה־CTD מתפקד כמו פלטפורמה דינמית. בכל שלב של השעתוק הוא מציג דפוס אחר של פוספורילציות, וכך הוא מגייס את החלבונים שמתאימים לאותו שלב.

פרומוטורים של Pol II

כמו בחיידקים, גם באאוקריוטים השעתוק מתחיל באזור promoter שנמצא לפני הגן.

תחילת השעתוק מוגדרת כעמדה: +1. מה שנמצא לפני תחילת השעתוק הוא upstream ומסומן במינוסים. מה שנמצא בתוך הגן הוא downstream ומסומן בפלוסים.

באאוקריוטים, הפרומוטור מורכב ממספר אלמנטים אפשריים. לא כל גן משתמש בכל האלמנטים.

Core promoter

ה־core promoter הוא האזור הקרוב ביותר לנקודת תחילת השעתוק. הוא כולל כמה רצפים אפשריים.

TATA box

TATA box הוא רצף עשיר ב־A ו־T, שנמצא בערך 30 בסיסים לפני תחילת השעתוק.

הוא מזוהה על ידי TFIID, בעזרת תת־יחידה שנקראת TBP - TATA-binding protein.

TBP נקשר ל־TATA box ומכופף את ה־DNA. הכיפוף הזה עוזר לפתוח את האזור ומאפשר קישור של שאר פקטורי השעתוק.

למרות ש־TATA box הוא האלמנט המוכר ביותר, הוא קיים רק בכ־20-30% מהגנים המקודדים לחלבונים. רוב הגנים אינם תלויים דווקא ב־TATA box.

BRE

BRE - TFIIB recognition element הוא רצף שמזוהה על ידי TFIIB.

יש שני BRE אפשריים:

• BRE upstream
• BRE downstream

הם נקראו כך מפני שהתגלו סביב TATA box, אבל הם יכולים להופיע גם בלי TATA box, וגם TATA box יכול להופיע בלי BRE.

Initiator

Initiator הוא אלמנט שנמצא ממש סביב transcription start site.

הרבה גנים משתמשים בעיקר ב־Initiator, גם בלי TATA box.

DPE

DPE - Downstream Promoter Element נמצא בתוך הגן, סביב +28 עד +32.

DPE אינו עומד לבד. הוא יכול לפעול יחד עם Initiator, ולייצב את הקישור של TFIID לאזור הפרומוטור.

Consensus sequences ו־IUPAC

הרצפים בפרומוטור הם consensus sequences. כלומר, הם אינם חייבים להיות זהים לחלוטין בכל גן, אבל יש להם תבנית כללית שמזוהה על ידי פקטורי שעתוק.

כדי לכתוב רצפי consensus משתמשים בקוד IUPAC.

לדוגמה:

• S = C או G
• R = A או G
• D = כל בסיס חוץ מ־C
• K = G או T

זה מאפשר לכתוב רצף שמייצג כמה אפשרויות, ולא רצף יחיד קשיח.

Proximal elements

מעבר ל־core promoter יש אלמנטים קרובים יותר שנקראים proximal elements. הם נמצאים עדיין באזור הפרומוטור, אבל רחוק יותר מה־transcription start site.

דוגמאות:

CAAT box

CAAT box הוא רצף שיכול להופיע בעותקים שונים לפני הפרומוטור.

הוא יכול להופיע יחד עם TATA box, יחד עם Initiator, או גם בנפרד. פקטורים כמו NFY יכולים להיקשר אליו ולעזור בגיוס פקטורי השעתוק הכלליים.

GC box

GC box הוא אלמנט חשוב מאוד, שמופיע בגנים רבים.

הרצף שלו עשיר ב־G ו־C, ונקשר אליו פקטור כמו SP1. SP1 יכול לסייע בגיוס TFIID.

GC box נפוץ במיוחד בגנים מסוג:

• Housekeeping genes
• גנים שקשורים להתפתחות
• גנים עם ביטוי tissue-specific

CpG islands

CpG islands הם אזורים ארוכים יחסית, בערך 1100 בסיסים, שעשירים ברצפי CpG.

הציטוזינים באזורים האלה יכולים לעבור מתילציה ולהפוך ל־5-methylcytosine.

כאשר CpG island אינו ממותל, הכרומטין פתוח יותר ויש אפשרות לביטוי גנים. כאשר יש הרבה מתילציה, האזור נוטה להיסגר להטרוכרומטין, והשעתוק יורד או נפסק.

General Transcription Factors ו־PIC

באאוקריוטים, Pol II לא מזהה לבד את הפרומוטור. הוא צריך קבוצה של חלבונים שנקראים General Transcription Factors - GTFs.

יחד עם Pol II הם יוצרים קומפלקס שנקרא PIC - Pre-Initiation Complex.

זה המקבילה המורכבת יותר של השימוש ב־sigma factor בחיידקים.

פקטורי השעתוק הכלליים

TFIID, TBP ו־TAFs

TFIID הוא פקטור גדול שמורכב מ־12 תת־יחידות.

אחת מתת־היחידות היא:

• TBP - TATA-binding protein

TBP נקשר ל־TATA box ומכופף את ה־DNA.

שאר תת־היחידות נקראות:

• TAFs - TBP-associated factors

השם שלהן היסטורי, אבל הן אינן רק “עוזרות” ל־TBP. לחלק מהן יש תפקידים עצמאיים בקישור לרצפים שונים ובבקרת שעתוק.

סדר בניית ה־PIC

במצב הקלאסי של גן עם TATA box:

1. TFIID נקשר לפרומוטור דרך TBP.
2. TFIIB נקשר ל־BRE ול־TFIID.
3. TFIIA יכול להצטרף ולייצב את הקומפלקס.
4. Pol II מגיע יחד עם TFIIF.
5. TFIIE ו־TFIIH מצטרפים.
6. TFIIH מזרחן את ה־CTD.
7. Pol II משתחרר מהפרומוטור ונכנס לשלב הבא.

לאחר ש־Pol II יוצא לדרך, חלק מהפקטורים משתחררים. TFIID ו־TFIIB יכולים להישאר על הפרומוטור, וכך לאפשר סבב נוסף של שעתוק במהירות גבוהה יותר.

Mediator ואלמנטים רגולטוריים רחוקים

השעתוק באאוקריוטים לא נקבע רק על ידי core promoter. יש גם אלמנטים רגולטוריים רחוקים שיכולים להיות אלפי בסיסים מהגן.

כדי להשפיע על הפרומוטור, האזורים האלה צריכים להתקרב אליו במרחב. זה נעשה בעזרת קיפול של ה־DNA ולולאות כרומטין.

Mediator

Mediator הוא קומפלקס גדול של כ־30 תת־יחידות.

הוא מחבר בין פקטורים רגולטוריים רחוקים לבין Pol II וה־PIC באזור הפרומוטור.

ל־mediator יש אזורים מבניים כמו:

• Head
• Body
• Tail

ה־head נקשר לאזור הפרומוטור ולפולימראז. ה־tail נקשר לפקטורים רגולטוריים רחוקים. כך mediator יכול לקרב enhancer או silencer אל אזור השעתוק.

Enhancers

Enhancers הם רצפי DNA שאליהם נקשרים activators.

הם יכולים להימצא רחוק מהגן, אבל באמצעות קיפול DNA הם מתקרבים לפרומוטור ומעודדים שעתוק.

Silencers

Silencers הם רצפי DNA שאליהם נקשרים repressors.

הם יכולים לדכא שעתוק, בין אם על ידי פגיעה בגיוס הפולימראז ובין אם על ידי השפעה על המבנה המקומי של הכרומטין.

Insulators ו־CTCF

Insulators הם רצפים שמגבילים השפעה של אזורים רגולטוריים.

אחד החלבונים המרכזיים שנקשרים אליהם הוא CTCF.

CTCF יכול להשפיע בשתי דרכים עיקריות:

1. למנוע מפגש פיזי בין enhancer לבין promoter.
2. למנוע התפשטות של הטרוכרומטין או מתילציה לאזור שצריך להישאר פתוח.

העיקרון כאן מרחבי מאוד: לפעמים הבקרה אינה “כימית” דרך שינוי חלבון מסוים, אלא פיזית. חלבון יושב במקום מסוים ב־DNA ומונע מאזור אחד להשפיע על אזור אחר.

שלבי השעתוק של RNA Polymerase II

לשעתוק על ידי Pol II יש שלושה שלבים כלליים:

1. Initiation
2. Elongation
3. Termination

אבל באאוקריוטים כל שלב מפוצל לתת־שלבים ויש עליו הרבה בקרה.

Initiation

ב־initiation נבנה ה־PIC על הפרומוטור.

GTFs נקשרים לאזור הפרומוטור, מגייסים את Pol II, ממקמים אותו נכון, ומאפשרים התחלה של סינתזת RNA.

Pol II מתחיל למשוך DNA לתוכו בדומה למנגנון scrunching בחיידקים. במקביל, TFIIH מתחיל לזרחן את ה־CTD, בעיקר על Ser5.

הפנוטיפ הראשון שצפוי להופיע ממוטציה שמונעת פוספורילציה של Ser5 בכל החזרות של ה־CTD של Pol II: פגיעה במעבר מ־initiation ל־elongation.

כאשר הפולימראז מצליח לסנתז RNA קצר, בערך מעל 10 בסיסים, הוא משתחרר מהפרומוטור.

בשלב הזה:

• TFIIE ו־TFIIH משתחררים.
• Pol II נשאר עם TFIIF.
• TFIID ו־TFIIB יכולים להישאר מאחור על הפרומוטור.
• הפולימראז מתקדם לתחילת הגן.

Promoter-proximal pausing

לאחר ש־Pol II יוצא מהפרומוטור, הוא לא תמיד ממשיך מיד לשעתוק מלא.

בערך אחרי 30 נוקלאוטידים הוא יכול לעצור. העצירה הזאת נקראת:

Promoter-Proximal Pausing - PPP

זה שלב בקרה חשוב מאוד. הפולימראז יכול להישאר עצור באזור הזה למשך שניות, דקות או אפילו שעות. לפעמים הוא לא ימשיך בכלל.

SPT4 ו־SPT5

בתחילת elongation נקשרים לפולימראז החלבונים:

• SPT4
• SPT5

SPT5 חשוב בין השאר לגיוס חלבוני capping.

NELF

NELF נקשר לקומפלקס וגורם לעצירה של Pol II.

כל עוד NELF קשור, הפולימראז לא ממשיך ל־productive elongation.

P-TEFb

כדי לשחרר את העצירה, צריך סיגנל.

הסיגנל מגיע דרך P-TEFb, שמבצע פוספורילציות על:

• NELF
• SPT5

בעקבות הפוספורילציות:

• NELF משתחרר.
• SPT5 נשאר על הפולימראז.
• נקשרים elongation factors.
• Pol II נכנס ל־productive elongation ומתחיל לשעתק את הגן בפועל.

Elongation ועיבוד ה־RNA תוך כדי שעתוק

בשלב elongation, Pol II מתקדם לאורך הגן ומסנתז RNA.

במקביל, ה־RNA החדש מתחיל לעבור processing. שלושת התהליכים המרכזיים הם:

1. Capping
2. Splicing
3. Polyadenylation

החיבור בין השעתוק לבין עיבוד ה־RNA נעשה במידה רבה דרך ה־CTD של Pol II.

Capping

כאשר Pol II נמצא קרוב לתחילת הגן, נקשרים חלבוני capping.

הם מוסיפים cap לקצה 5’ של ה־mRNA החדש.

ה־cap חשוב כי הוא מגן על ה־RNA מפני דגרדציה.

Splicing

כבר בזמן שה־RNA מסונתז, מתחילים להיקשר אליו חלבוני splicing.

Splicing כולל הוצאה של אינטרונים וחיבור של אקסונים.

פוספורילציות על Ser2 וגם Thr4 ב־CTD קשורות לגיוס חלבוני splicing.

Proofreading של Pol II

Pol II יכול לטעות בהכנסת נוקלאוטיד.

כאשר נכנס נוקלאוטיד לא נכון, נוצר חוסר התאמה בין ה־RNA לבין ה־DNA. הפולימראז יכול לזוז אחורה, והקצה השגוי של ה־RNA בולט החוצה. אז אנזים חותך את המקטע הקצר, ו־Pol II יכול להמשיך לסנתז מחדש.

זה סוג של proofreading, אבל הוא שונה מ־proofreading של DNA polymerase.

מה יכול להשפיע על מהירות elongation?

Pol II לא מתקדם במהירות קבועה לגמרי. הוא יכול להאט או להתקדם מהר יותר לפי מה שהוא פוגש לאורך הגן.

גורמים שיכולים להשפיע:

• חלבונים הקשורים ל־DNA.
• מודיפיקציות על היסטונים.
• מבנים שניוניים של DNA.
• מצב הכרומטין באזור.

כל אלה הם חלק מבקרת ביטוי גנים.

Termination ו־polyadenylation

בסוף הגן Pol II מגיע לאזור שנקרא:

• PAS - Polyadenylation Site

שם מופיע רצף שמאפשר קישור של קומפלקס חלבוני שנקרא:

• CPA - Cleavage and Polyadenylation Complex

CPA

CPA עושה שני דברים:

1. Cleavage - חיתוך של ה־RNA החדש.
2. Polyadenylation - סיוע בהוספת poly-A tail.

לאחר החיתוך, poly-A polymerase מוסיף את זנב ה־poly-A.

בשלב הזה ה־RNA כבר הופך מ־pre-mRNA ל־mRNA בשל יותר, שמוכן להמשך עיבוד, יציאה מהגרעין ותרגום.

איך Pol II מפסיק לשעתק?

גם אחרי שה־mRNA נחתך וה־poly-A tail מתווסף, Pol II עצמו לא עוצר מיד. הוא ממשיך לסנתז עוד בערך 500 עד 2000 בסיסים.

ה־RNA שנוצר אחרי נקודת החיתוך אינו מקבל cap, ולכן הוא לא יציב ועובר דגרדציה.

בשלב הזה נקשרים חלבוני סיום כמו:

• PNUTS
• PP1

הם מורידים פוספורילציה מ־SPT5, וזה גורם להאטה של Pol II.

ההאטה מאפשרת לאקסונוקלאז “לרדוף” אחרי Pol II על גבי ה־RNA, בדומה עקרונית ל־Rho-dependent termination בחיידקים. כאשר האקסונוקלאז מגיע אל הפולימראז, הוא מפרק את הקומפלקס ו־Pol II משתחרר מה־DNA.

כך מסתיים השעתוק של הגן.